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实验 9 T 载体克隆的 DNA 序列分析 实验目的： 了解常规DNA 序列分析技术（Sanger 双脱氧法）的原理及操作步骤。 实验原理： 在分子生物学研究中，DNA 的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用 于测序的技术主要有 Sanger 等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam 和 Gilbert（1977） 发明的化学降解法。两种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始， 随机在某一个特定的碱基处终止，产生 A ，T，C，G 四组不同长度的一系列核苷酸，然后 在尿素变性的 PAGE 胶上电泳进行检测，从而获得 DNA 序列。目前 Sanger 测序法得到了广 泛的应用。 Sanger 法测序的原理就是利用一种 DNA 聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。 直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含 有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP) ，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸 (ddNTP) 。由于ddNTP 缺乏延伸所需要的 3-OH 基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在 G、 A 、T 或 C 处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种 dNTPs 和 ddNTPs 的相对浓 度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但 终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后 可用 X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。 图9-1 Sanger 双脱氧法 DNA 测序原理 自动化测序实际上已成为当今DNA 序列分析的主流。美国 PE ABI 公司已生产出 373 型、377 型、310 型、3700 和 3100 型等 DNA 测序仪，其中 310 型是社会上提供 DNA 测序 服务的生物技术公司中使用最多的一种型号。本实验介绍的是 ABI PRISM 310 型 DNA 测序 仪的测序原理和操作规程。 310 型基因分析仪（即 DNA 测序仪），采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板 电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法) ，因此通过单引物PCR 测序反应，生成的 PCR 产物则是相差 1 个碱基的 3末端为 4 种不同荧光染料的单链 DNA 混 合物，使得四种荧光染料的测序 PCR 产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移 率差异的影响，大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也 不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的 CCD(charge-coupled device)摄影 机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息 的不同颜色的荧光，并在CCD 摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为 DNA 序列，从而达到 DNA 测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列 顺序等多种形式输出。它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控 制的测定 DNA 片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。PE 公司还提供凝胶高分子 聚合物，包括 DNA 测序胶（POP 6 ）和GeneScan 胶（POP 4 ）。这些凝胶颗粒孔径均一，避 免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、Macintosh 电脑、彩色 打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集，分析和仪器运行等软件。它使用最新的 CCD 摄影机检测器，使 DNA 测序缩短至 2.5h ，PCR 片段大小分析和定量分析为 10～40min 。 由于该仪器具有 DNA 测序，PCR 片段大小分析和定量分析等功能，因此可进行 DNA 测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段PCR 、RT-PCR(定 量 PCR)等分析，临床上可除进行常规 DNA 测序外，还可进行单核苷酸多态性(SNP)分析、 基因突变检测、HLA 配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。 实验材料： 1、客户端： 测序模板：可以是 PCR 产物、单链 DNA 和质粒 DNA 等。模板浓度应调整在 PCR 反应时取量 1μl 为宜。 A. 含待测质粒 DNA 的菌液：细菌繁殖和质粒DNA 抽提工作交给公司做。