基因工程与基因打靶.pptVIP

医学资料 21世纪三大重中之重高新技术 生物技术（BT) 信息技术（IT） 新材料技术（纳米技术，NT） （2）50年代搞清楚了DNA的双螺旋结构和 半保留复制机理。 技术上的三大发明 基因本身也是一个产业 Rockfeller 大学将人肥胖基因出售0.2亿美元（1995年3月） Amgen公司将FKBP神经免疫因子配体转让达3.29亿美元（1997年） Millennium公司以4.65亿美元向Bayer公司转让225种基因的开发权（1998年9月） 胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。 将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素！大规模工业化生产不但解决了这种比黄金还贵的药品产量问题，还使其价格降低了30%-50%! 干扰素治疗病毒感染简直是“万能灵药”！过去从人血中提取，300L血才提取1mg！其“珍贵”程度自不用多说。 基因工程人干扰素α-2b（安达芬） 是我国第一个全国产化基因工程人干扰素α-2b，具有抗病毒，抑制肿瘤细胞增生，调节人体免疫功能的作用，广泛用于病毒性疾病治疗和多种肿瘤的治疗，是当前国际公认的病毒性疾病治疗的首选药物和肿瘤生物治疗的主要药物。 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 相关概念 DNA克隆 重组DNA技术的基本原理与操作过程可形象归纳为： 分：分离目的基因 切：限制酶切目的基因与载体 接：拼接重组体 转：转入受体细胞 筛：筛选重组体 基因文库是指通过克隆方法保存在适当宿主中的一群混合的DNA分子，所有这些分子中的插入片段的总和，可代表某种生物的全部基因组序列或全部mRNA序列，因此基因文库实际上是包含了某一生物体或生物组织样本的基因序列的克隆群体。 包括两类：基因组文库和cDNA文库。 第二部分 基因打靶 基因打靶（gene targeting）是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。若定向敲除某个基因，称为基因敲除（gene knockout）；若定向将一段基因序列替代另一段基因序列，则称为基因敲入（gene knock-in）。 目前这种技术主要在小鼠ES(embryonic stem cell)细胞中进行。 ????我国科学家率先掌握“基因打靶”技术的是第二军医大学附属东方肝胆外科医院殷正丰教授。 因为“基因打靶”是精确、定点地改造动物基因组，而通常的转基因方法无法判断和控制基因移往何处，移植的后果不可预测也不可控制，因此其具有许多好处。如：安全性正遭到怀疑的基因药物和转基因食品将更加安全，因为基因移植的位点是事先确定的，转移后的副作用事先可避免。第二，通过控制基因移植，克隆动物也可以“优生优育”。第三，通过“基因打靶”，可以有选择地将某些动物基因删除，并转入人的有关基因，这样培养出来的动物器官可以避免排异反应，安全有效地移植到人体。　??? 一、基因打靶的必备条件 1. 胚胎干细胞(ES细胞) ES细胞是取自小鼠胚胎早期的内细胞团，即小鼠受精卵发育第4、5天的胚泡细胞。ES细胞的特点：能在体外培养，并保留发育的全能性。ES细胞体外贴壁生长时的形态特征是：核大，胞浆少，细胞排列紧密，呈集落样生长。在体外培养增殖过程中,ES细胞有一种向多种组织类型分化的趋势。 将ES细胞进行体外遗传操作后,重新植回小鼠胚胎,可发育成胚胎的各种组织,最后形成嵌合体小鼠(chimeric mouse) 。如果这种ES细胞能发育成小鼠的生殖细胞,再通过交配就可得到基因敲出或敲入的小鼠。 2. 打靶载体 打靶载体含有两种筛选标志：neo（新霉素）阳性筛选标志；HSV－tk阴性筛选标志,通过正负选择，可以大大地提高外源基因在染色体特异位点的整合细胞筛选的阳性率。 （1）neo阳性筛选标志:将neo(neomycin phosphotransferase，新霉素磷酸转移酶)基因插入用于打靶的外源DNA中。当外源DNA与细胞染色体上的同源序列发生同源重组时，neo基因也被插入到染色体，因此，发生同源重组的ES细胞能在含G418(新霉素衍生物)的培养基中生长。 （2）HSV-tk阴性筛选标志：HSV-tk是来源于单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase)基因，它编码TK