弹性蛋白酶抑制剂筛选用蛋白质芯片和化合物阵列的设计与应用①.pdfVIP

高技术通讯 　2006 年 6 月 第 16 卷 第 6 期 弹性蛋白酶抑制剂筛选用蛋白质芯片和化合物阵列的设计与应用① 高 　峰② 　杜冠华 ③ ( 中国医学科学院 中国协和医科大学药物研究所 , 国家药物筛选中心 　北京 100050) ( ) 摘 　要 　介绍了用于筛选弹性蛋白酶抑制剂的化合物阵列 药物筛选生物芯片 的设计与 应用。这种化合物阵列芯片由活性蛋白酶膜、化合物阵列及底物微阵构成。其主要原理 是弹性蛋白酶与显色底物反应之后 ,可以催化底物转化为显色产物 ,根据颜色的差异 ,可 以确定化合物是否对酶活性具有抑制作用以及抑制作用的强弱。为提高检测灵敏度,在 反应系统中加入了与反应产物形成颜色反差的生物指示剂溴酚蓝作为背景。当酶与底物 反应时 ,底物转化为黄色的产物 ,在背景色中呈现绿色 ;当酶活性被化合物抑制时 ,无黄色 底物生成 ,点样点呈背景蓝色。使用该化合物微阵列方法对 11680 个化合物进行了筛选 , 发现了两个抑制作用较强的化合物 ,并通过常规的微孔板方法证明了筛选结果的准确性。 说明化合物阵列蛋白质芯片方法是有效、灵敏的高通量筛选方法。 关键词 　蛋白质芯片 , 化合物阵列 , 弹性蛋白酶 , 高通量筛选 酶芯片操作的关键技术。目前研究最多的酶芯片主 0 　引 言 要应用于研究蛋白激酶活性 ,一般是将磷酸化底物 在当前生命科学研究中 ,建立在蛋白质微阵列 固定在载体上 ,暴露于激酶和放射性标记的 ATP 的 技术基础之上的分析系统已在蛋白质的定性、定量 混合液中 ,孵育一段时间后 ,放射自显影检测含有放 及功能分析中得到广泛应用 ,相对于传统方法 ,蛋白 射性标记的位点 , 以此来判断激酶作用的底物。这 质微阵列的主要优势体现在它的快速、简便与低 种方法灵敏度高 , 但只适用于蛋白修饰酶系 耗[1 ,2 ] 。 统[1113 ] 。更多的酶和底物相互作用之后 ,会使底物 蛋白质微阵列技术的特点对于药物的高通量筛 发生水解或裂解 ,使其不能再固定在载体上 ,因此不 选具有重要的意义。但是 ,蛋白质微阵列技术在药 能使用常规的孵育方法来操作。现在也有人从事其 物筛选中的应用还非常有限 ,其主要原因是药物筛 它酶的研究 ,Dhaval N[14 ] 等将药物溶于甘油与二甲 选不仅需要蛋白质与化合物自由结合 ,而且要求定 基亚砜的混合液中点样于空白玻片上 ,然后将酶和 位于载体上的蛋白质具备正常的立体结构和生物活 荧光底物分别喷雾在液滴上 ,通过甘油的吸水性能 性。目前 ,虽然蛋白已经成功定位于多种基质上 ,如 创建一个反应的微环境 ,通过荧光检测来判断药物 PVDF 膜、聚丙烯酰胺水凝胶、硝酸纤维素膜、聚赖氨 是否对酶有抑制作用。这种方法更好地保证了酶反 酸包被板、聚苯乙烯板、树脂板、环氧板、抗生物素蛋 应的液体环境 ,但由于一般样品库中都不加入甘油 , 白包被板、硅烷化处理板、醛基化板等[310 ] ,但是用 所以这种方法要求对药物进行特殊的预处理 , 同时 , 这些方法定位的蛋白质往往不能达到药物筛选的要 喷雾的均匀性也难以控制。也有人使用溶胶 —凝胶 求 ,因而制约着蛋白微阵技术在药物筛选中的应用。 封装的方法作为一种蛋白定位的方式[15 ] , 因为蛋白 与其它类蛋白之间的相互作用不同 ,酶和底物 能被诱导进入一种合适载