细胞培养技术实验细胞培养的无菌操作.pptVIP

细胞培养的无菌操作 【培养前准备】 根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。这可以避免开始实验后．因物品不全往返拿取而增加污染机会。 【操作野消毒】 无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次(拖布要专用)．紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置．否则会遮挡射线降低消毒效果。—些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。 【洗手和着装】 原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时，可穿经细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75％酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。 【火焰消毒】 一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。 但要注意： 金属器械不能在为焰中烧的时间过长，以防退火，烧过的金属镊要待冷却后才能挟取组织，以免造成组织损伤。 吸取过营养液后的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管头中营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有害物带入营养液中。 开启、关闭长有细胞的培养瓶时，火焰灭菌时间要短。防止因温度过高烧死细胞。 胶塞过火焰时也不能时间长，以免烧焦产生有毒气体，危害培养细胞。 【操作】 动作要准确敏捷，但又不必太快。 不能用手触及已消毒器皿的使用端。 右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。 培养液在未用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口。 吸取营养液、PBS、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管。 工作中不能面向操作野讲话或咳嗽手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方。 瓶口最易污染，加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸管丢掉。 实验二 常用仪器设备的使用 一、实验目的 掌握细胞培养中常用仪器设备的使用和保养方法 二、器材 双重纯水蒸馏器 CO2培养箱 压力蒸汽消毒器 净化台 倒置显微镜 ? 三、操作（一）CO2培养箱 1．投入运行前的准备工作 1）给培养箱和附件进行消毒：用75％酒精浸泡过的纱布擦拭培养箱内壁和附件进行灭菌消毒，然后用无菌干纱布将酒精擦除干净，这项工作应定期进行。 2）待箱内酒精挥发干净后，将箱内温度设定为37℃，CO2浓度设定至0％（设定方法见下面的相关内容），这种状态维持8h以上。这步操作适用于首次启动运行或长时间未用。 3）用配套的供气管将CO2储气瓶的减压器与培养箱连接起来。注意检查接点是否漏气。 （一）CO2培养箱 气瓶减压器是用来调节CO2供气量的装置，它由双表组成，左表是低压表，右表是高压表，高压表连接螺杆。其使用方法如下： ①打开CO2储气瓶前，先按逆时针方向旋转减压器调节螺杆，直到调节弹簧不受压力为止。 ②把CO2储气瓶阀门缓慢打开，高压表指示瓶内气体量读数。③按顺时针方向轻轻旋转减压器调节螺杆，使CO2减压，当低压表指针指到0.03Mpa时，松动低压表的出口，使CO2气体缓慢流入培养箱。若压力超过0.03Mpa时，需再旋转螺杆，放出一部分气体后再调节。整个调节过程要细心、缓慢，若进入培养箱的CO2压力过高，可冲破培养箱的CO2调节装置或将供气管弹开，导致CO2培养箱CO2调节量失控。 （一）CO2培养箱 2．设定培养箱温度和CO2浓度 通常CO2培养箱的使用条件为37℃，5％CO2。其设定程序见下表： 操作说明 所操作的键 操作之后的指示 1 打开电源开关 温度指示器显示当前箱内温度 2按SET键 SET 温度指示器中数字闪烁 3按下 键和 键， 按下该键，可使数字移位 将数字设定到37.0 按下该键，可使数字增加 4按下ENT键 ENT