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生物化學實習 實驗 6-5 電泳檢測質體 DNA 一、目的 瞭解瓊脂醣電泳分離質體 DNA 之原理與操作方法。 二、原理 利用瓊脂醣電泳，可分離 DNA 。因DNA 帶負電，均往正極移動，所以 DNA 在電場移動快慢只和分子大小及結構有關。用已知分子量標準品與 DNA 樣品一起 進行電泳分析，由分子量取對數及移動距離作圖，可求得 DNA 片斷之分子量。進 行電泳前必須先行鑄膠，將瓊脂醣熱溶再冷凝，洋菜膠會以氫鍵形成凝膠。不同 濃度（0.3~2.0 % ）之瓊脂醣可用於分離不同大小之DNA 片段(200 bp~ 50kb)(如表 6-3) 。在膠體中之DNA 可經 ethidium bromide (EtBr)染色，EtBr 會嵌入 DNA 鹼基 中，以紫外線照射， DNA 會吸收紫外線波長的光線，再經 EtBr 放出可見波長的 光線，藉以觀察 DNA 的位置。 表 6-3 依照所要分離 DNA 的大小，決定凝膠中洋菜凝膠濃度 洋菜凝膠濃度(%) 質體 DNA 的有效分離範圍(kb) 0.3 5~60 0.6 1~20 0.7 0.8~10 0.9 0.5~7 1.2 0.4~5 1.5 0.2~4 2.0 0.1~2 175 第六單元 核酸與重組 DNA 技術 三、 儀器與試劑 (一) 電泳槽。 (二) 微量分注器(pipetman) 。 (三) 10X TBE buffer (0.89M Tris-HCl, 0.89M boric acid, 0.02M EDTA) (四) 0.7％ agarose 溶於 0.5x TBE buffer (五) Ethidium bromide (EtBr) (10mg/mL) (六) 6×DNA loading dye 四、實驗步驟 (一) 1％瓊脂醣之配置 (圖 6-5) 秤取 0.5 克瓊脂醣粉末，加入 50mL 之 0.5× TBE ，以微波加熱至煮沸溶解， 混合均勻，冷卻至約 50 ，倒入插有齒狀模型之模中，靜置20-30 分鐘，使 其凝膠。 (二) 凝膠後，將膠置入含 0.5x TBE buffer 電泳槽內(圖 6-4) 。 (三) 準備樣品，步驟如下: 質體 DNA 5µl 6x DNA loading dye 1µl Total 6µl (四) 每孔加入 6 µl 的樣品 (五) 電壓 100V 電泳 25-30 分鐘 (六) 關掉電泳，取出膠體，浸入含 EtBr(10mg/mL)之染劑中染約 5 分鐘 (注意 ：EtBr 為致癌劑，操作時務必帶手套!) (七) 置於 UV 照像裝置上(圖 6-6) ，觀察膠片並照相，計算分子量。 176 生物化學實習 電源 電泳槽 供應器