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美好明日 美好未来 细胞/动物组织基因组 DNA 纯化方法 1. 细胞基因组 DNA 提取方法 1. 贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。 2. 细胞重悬于冰冷的 PBS 漂洗一次，离心收集。 3. 重复 2 。 4. 加入 5ml DNA 提取缓冲液，(10m mol/L Tris-cl, 0.1 mol/L EDTA, o.5% SDS),混匀。 5. 加入 25ul 蛋白酶 K ,使终浓度达到 100ug/ml, 混匀，50℃水浴 3h, 6. 用等体积的酚抽提一次，2500r/min 离心收集水相， 用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min 离心收集水相。 用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。 7. 加入等体积的 5mol/L 的LiCL,混匀，冰浴，10min. 8. 2500r/min,离心 10min. 转上清与一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温 10 分钟。 9. 2500r/min,离心 10min。弃上清。 加入 0.1 倍 体积 3mol/L 乙酸钠(PH5.2)与 2 倍体积-20℃预冷无水乙醇。-20℃ 20 分钟。 10. 12000r/min, 室温离心 5 分钟。弃上清。将 DNA 溶于适量 TE 中。 2. 动物组织基因组 DNA 提取方法 在许多 DNA 研究工作中，需要直接从新鲜或冻存的动物组织（如肝、脑、肺、鼠尾等）中制备高分子量 DNA 。 与提取细胞基因组 DNA 相似，操作前应确定需处理的动物组织样品最大量，以免造成组织裂解不彻底及 DNA 得量和 纯度的下降。与培养细胞相比，从动物组织制备 DNA 更为困难。动物组织难以破碎，用一般匀浆方法捣碎组织容易 引起 DNA 断裂，而且时间比较长，在此期间 DNA 可能会被 DNA 酶降解，因此用一般方法难以从动物组织中大量制 备高分子质量的基因组 DNA 。 2.1 操作步骤: 1. 切取组织 5g左右，剔除结缔组织，吸水纸吸干血液，剪碎放入研钵(越细越好)。 Notice ：常规动物组织样品的处理方式和注意事项 新鲜组织：刚刚离体的新鲜动物组织 25mg （小鼠尾0.6-1.2cm，大鼠尾 0.6 cm ）用剪刀剪切成小块，移入预冷的 研钵或匀浆器中，快速、用力研磨或匀浆 冻存组织：不能立刻提取 DNA 的组织样品应置于液氮或-70 度冰箱中保存并避免反复冻融。取出冻存样品，放 入预冷的研钵或匀浆器中，加入少许液氮快速、用力研磨成粉末状。 需要特别注意的部分组织样品： 某些组织样品因匀浆比较困难或匀浆过程中 DNA 容易降解，建议无论新鲜组织，还是冷冻保存的样品，都 应按照冻存组织样品的处理方式进行 2. 倒入液氮，磨成粉末，加 10ml分离缓冲液。 3. 加 1ml 10% SDS，混匀，此时样品变得很粘稠。 4. 加 50ul或 1mg 蛋白酶 K ， 37 ℃保温 1-2 小时，直到组织完全解体。 5. 加 1ml 5mol/L NaCl，混匀，5000rpm离心数秒钟。 6.取上清液于新离心管，用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提。待分层后,3000rpm离心 5 分钟。 7. 取上层水相至干净离心管，加 2 倍体积乙醚抽提(在通风情况下操作)。 8. 移去上层乙醚,保留下层水相。 9. 加 1/10 体积 3mol/L NaAc，及 2 倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。室温下静止 10-20 分钟，DNA沉淀形成 白色絮状物。 北京明日百傲生物科技发展研究所 01062819319 美好明日 美好未来 10. 用玻棒钩出DNA沉淀，70%乙醇中漂洗后,在吸水纸上吸干，溶解于 1ml TE中，-20℃保存。 11. 如果DNA溶液中有不溶解颗粒，可在 5000rpm短暂离心，取上清