人脐带间充质干细胞复合海藻酸钙水凝胶支架材料构建组织工程软骨的实验研究.pdfVIP

暨南大学硕士论文 中文摘要 目的：体外分离培养人脐带间充质干细胞，并对其进行生物学鉴定及软骨方向诱导。构 建海藻酸钙水凝胶，同时观察其生物相容性。检测人脐带间充质干细胞与海藻酸钙水凝胶 构建组织工程软骨修复软骨缺损的效果。 方法：用酶消化法分离培养人脐带间充质干细胞，通过传代培养，扩增。倒置光学显微 镜及原子力显微镜观察细胞形态。MTT 检测细胞增殖曲线，流式细胞仪检测细胞周期及 免疫表型。在低密度、高密度、微团的环境下对 hUCMSCs 向软骨方向诱导。诱导成软骨 过程中应用倒置光学显微镜观察细胞结构的变化，并对不同组别进行甲苯胺蓝杂色、免疫 组化检测。制备海藻酸钙水凝胶支架材料。将 hUCMSCs 与支架材料复合，体外成软骨诱 导培养 3 周，扫描电镜观察细胞黏附情况，MTT 法分析细胞增殖情况来评价其组织相容 性。并通过原位植入兔股骨髁上软骨缺损，通过组织学等手段检测其软骨修复效果。低 密度诱导组与各对照组免疫组织化学染色可见部分细胞浆内散在棕色，颜色较淡；高密 度诱导组和微团诱导组可见细胞内外基质均有棕色着色，细胞密集处颜色较深，微团诱 导组着色更深。 结果：采用酶消化法能有效分离纯化人脐带间充质干细胞。细胞增值能力强。流式细胞 仪分析第 3 代细胞均强烈表达 CD29、CD44、CD105，不表达 CD34、CD45 和 HLA-DR 。 经成软骨诱导分化后，低密度诱导组及各对照组甲苯胺蓝杂色、Ⅱ型胶原免疫组化染色弱 阳性；高密度诱导组甲苯胺蓝杂色、Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性，微团诱导组染色均表现 出强阳性。扫描电镜示细胞海藻酸钙水凝胶支架上吸附，生长良好。MTT 示 hUCMSCs 在材料上增殖能力良好。hUCMSCs 构建的组织工程软骨能够修复软骨缺损。 结论：本实验建立了一套体外稳定培养扩增人脐带间充质干细胞的方法，所培养的细胞 成分单一，扩增迅速，生物学形状稳定；并能使其在体外采用不同环境下诱导向成软骨细 胞分化。海藻酸钙水凝胶支架材料是一种具有良好生物相容性的支架材料。hUCMSCs 与 之构建组织工程软骨可修复软骨缺损。 关键词：脐带，间充质干细胞，软骨，海藻酸钙，组织工程。 I 暨南大学硕士论文 Abstract Objective: To isolate and culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells （hUCMSCs ） in vitro,identify their biological characteristic,and induce hUCMSCs differentiate into cartilage cells in different conditions.Calcium alginate column was manipulated and observed its biocompatibility,and investigate the potential of tissue engineered cartilage to heal a segmental defect in the rabbits. Methods: The hUCMSCs were isolated from human umbilical cord by digested with collagenase. After serial subcultivation in vitro, the stem cells were passaged. Morphologic appearance of hUCMSC was observed by an optical micro