融合蛋白lhFVII-LDM的制备及其对乳腺癌细胞的抑制作用.pdfVIP

中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2011, 33(9): 976–982 http ://www.cj 融合蛋白lhFVII-LDM 的制备及其对乳腺癌细胞的 抑制作用 胡 莲 廖东升 吴传芳* ( 四川大学生命科学院功能基因组实验室, 成都610064) 摘要 该文主要研究了强化融合蛋白lhFVII-LDM对乳腺癌MDA-MB-231细胞的抑制作用。 通过PCR和重叠PCR的方法构建了pET 19b-lhFVII-LDP表达载体, 重组质粒转化BL2 1, 经IPTG诱导 后表达并用Co2+ 亲和层析纯化lhFVII-LDP融合蛋白, Western blot检测融合蛋白的正确性, 再通过 分子重组的方法将lhFVII-LDP与力达霉素(LDM)的活性发色团(AE)组装成为强化融合蛋白lhFVII- LDM 。通过免疫共沉淀实验鉴定lhFVII-LDP与组织因子(TF)的特异性结合作用, 利用平板克隆形成 实验观察lhFVII-LDM对细胞增殖的影响, 采用Hoechst33342染色检测lhFVII-LDM诱导MDA-MB- 231细胞凋亡情况, 建立了人乳腺癌裸鼠肿瘤模型, 研究lhFVII-LDM对MDA-MB-231肿瘤生长的抑 制作用。结果显示, lhFVII-LDM强化融合蛋白在体外能很好的诱导MDA-MB-231细胞凋亡, 动物 实验结果表明, 强化融合蛋白对MDA-MB-231肿瘤的生长具有显著的抑制作用。 VII LDM MDA-MB-231 关键词 凝血因子 ; ; 肿瘤抑制; 细胞; 表达纯化 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一, 其发病 导致双链DNA 的断裂, 从而诱导细胞的凋亡[9-13], 并 率逐年增高, 传统的治疗方式不仅花费高, 而且易复 且它是迄今为止报道过的对肿瘤细胞杀伤作用最强 发, 寻求新的治疗方法已成为人们的迫切需要。近 的大分子肽类抗肿瘤抗生素[14] 。但是由于LDM在杀 年来, 分子靶向治疗已成为肿瘤治疗中的一个热点, 死肿瘤细胞的同时对正常细胞或组织也有很强的毒 目前已经有多种分子靶向治疗药物应用于肿瘤的治 害作用, 一般动物对LDM 的耐受剂量只有0.05 mg/kg, 疗[1-2] 。此外, 与传统化疗相比, 抗肿瘤靶向药物因其 所以单独使用LDM治疗肿瘤会给机体带来严重的毒 能够提高疗效且大幅度降低药物的毒副作用而在药 副作用, 因此, LDM被作为研制抗肿瘤靶向药物高效 物的研发领域受到广泛的关注。 的“弹头”药物[15] 。 组织因子(TF)是一种在正常组织血管内皮细胞 本文根据FVII和LDM 的特点, 把具有强肿瘤细 不表达, 但在实体瘤新生血管内皮细胞和恶性肿瘤 胞杀伤作用的“弹头”药物LDM和具有强靶向性的 细胞表面特异性表达的细胞表面受体[3-5], 因此, TF lhFVII联合起来, 制备以lhFVII为载体、LDM为“弹 可以作为治疗肿瘤的有效靶点, 本文所研究的乳腺 头”的肿瘤靶向药物lhFVII-LDM, 并研究其对TF高 [6-7] 癌MDA-MB-231细胞就是高表达TF 的细胞系 。 表达的乳腺癌MDA-MB-231细胞的体外杀伤作用以 凝血因子VII (FVII)是TF 的天然配体, 使用不同的实 及体内抑瘤活性。 验方法测得它们相互作用的Kd值在10-8~ 10-11 mol/L 之间[3] 。凝血因子VII (FVII) 由轻链(lhFVII, 20 kDa) 1 材料与方法 和重链(hhFVII, 30 kDa)两部分组成, 并且研究证明