鱼塘生态体系沙门氏菌的耐药性及耐药基因分析.pdfVIP

摘要 养殖业中抗生素的大量使用加重了细菌对抗生素产生耐药性，并且具有耐药性的病原 菌可能会通过食物链传播给人类，使人体变成耐药基因的储存库，严重危害人类健康。养 殖业和环境的细菌耐药性问题已经引起全球的普遍关注。 本论文研究了广东省佛山南海鱼塘生态体系中沙门氏菌的发生率及其耐药水平，检测 了沙门氏菌携带的不同耐药基因。采集样本包括组成鱼塘生态体系的草鱼、肉鸭、鱼生活 圈水土以及鸭生活圈水土，通过生化鉴定和PCR 鉴定后共检出沙门氏菌34株（鱼肠6株， 鱼塘土6株，鱼塘水5株，鸭肠6株，鸭场土6 株，鸭场水5株），鱼塘水和鸭场水的沙 门氏菌检出率为7.1%，其余均为8.6%。通过PCR-DGGE（变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）技 术分析养殖体系的菌群结构，显示动物肠道及环境中细菌群落具有多样性和特异性，各自 拥有不同位微生态丰度和优势菌群。采用Kirby-Bauer 法对17种抗生素进行体外敏感性试 验，包括氨苄西林、链霉素、新霉素、头孢他啶、头孢噻肟、萘啶酮酸、甲氧苄啶、复方 磺胺、复方新诺明、氯霉素、四环素、呋喃妥因、红霉素、青霉素、多粘菌素B、替加环 素和氟苯尼考。药敏结果显示，从鱼塘生态体系分离的沙门氏菌耐药现象十分普遍，所有 菌株均表现为3重及3重以上的多重耐药现象，其中97%的耐药组合表现为氨苄西林/新霉 素/红霉素/青霉素共同耐药，而对头孢类、呋喃妥因及多粘菌素B 耐药率较低，对替加环 素则表现敏感。 本研究建立了多重PCR反应体系检测沙门氏菌的22种耐药基因，包括aadA,aac(3)-I, aphA1, aac(3)-IV,ereA, MOX, DHA, EBC, FOX, CIT, bla ,bla , bla , tetA,tetB, SHV OXA TEM tetC, sulI, dhfrI, dhfrV，catI, cmlA和floR。采用七重PCR 反应体系检测耐药基因sulI、 bla 、catI、dhfrV、floR、aadA和bla ，两个六重PCR 反应体系分别检测耐药基因bla 、 SHV OXA TEM cmlA、CIT、ereA、dhfrI、aac(3)-I和耐药基因aphA1、MOX、DHA、EBC、aac(3)-IV、FOX， 同时采用三重PCR 反应体系检测3种四环素耐药基因（tetA、tetB、tetC）。结果显示，来 自不同养殖体系的34株沙门氏菌被检出有17个耐药基因（ereA、FOX、bla 、catI和tetC SHV 基因未检出），其中氨基糖苷类耐药基因检出率aadA＞aphA1＞aac(3)-IV＞aac(3)-I；氨苄 青霉素类耐药基因检出率CIT＞DHA＞EBC；β内酰胺类耐药基因检出率bla ＞bla ； OXA TEM 四环素类耐药基因检出率tetA＞tetB，其中tetC未检出；磺胺类耐药基因sulI的检出率为 32.4%；甲氧苄啶类dhfrV和dhfrI的检出率分别为11.8%和5.9%；氯霉素类基因检出率cmlA ＞floR，分别为17.6%和8.8%。药敏试验的表现型与基因型结果比较：大部分阳性符合率 I 高于40%，其中氨基糖苷类的阳性符合率最高为52.9%，建立的多重PCR 反应体系具有快 捷省时、特异性高等特点。 本研究还采用三重PCR 反应体系检测34株耐药沙门氏菌携带整合子（intI1，2，3） 的情况，并针对第1类整合子（intI1）阳性菌株进一步以保守序列引物扩增整合子的可变 区。结果显示整合子广泛分布于各菌株中，91.2%的菌株能检测出整合子的存在，其中的 30株含有1类整合子，有1株同时检测出1类和2类整合子，未检出3类整合子。并且intI1 可变区扩增片段大小有两种分别为1600bp 和160bp，说明鱼塘生态体系中耐药沙门氏菌的 1类整合子中普遍存在一个以上的耐药基