水稻端粒酶RNA模板基因序列鉴定体系的建立.pdfVIP

浙江理工大学学报，第30卷，第4期，2013年7月 of Sci—Tech Journal Zhejiang University V01．30，No．4，Jul．2013 文章编号：1673—3851(2013)04—0590—05 水稻端粒酶RNA模板基因序列鉴定体系的建立 杨力媛，郑洁，马登旭，马国兴，刘ibJIl (浙江理工大学生物工程研究所，杭州310018) 摘要：利用水稻端粒酶对端粒序列的合成作用，对模板基因序列进行定点突变，构建了pCambial301一T突变 型、pCambial301一Y野生型载体。经农杆菌介导，选用水稻不同品种和组织，探索候选序列的鉴定体系。结果显示， 不同水稻品种诱导愈伤，差异显著，其中中花11号可快速诱导愈伤，比广陆矮4诱导时间缩短一半，用成熟胚和幼胚 分别诱导愈伤，无明显差异；对突变型、野生型、正常组织进行基因组DNA端粒鉴定和端粒酶活性分析，发现突变型 端粒酶活性明显高于对照。这些均表明该鉴定体系完整、可靠，为端粒酶RNA模板基因序列的鉴定建立了有效的 方法。 关键词：水稻；端粒酶RNA；模板序列鉴定技术；定点突变 中图分类号：Q785 文献标志码：A 同时，在水稻转基因过程中，宿主菌和诱导环境 0 引 言 的选择也很重要。农杆菌多应用于双子叶植物转基 端粒酶通过识别端粒末端序列，与自身携带的 因，但对一些重要的单子叶植物，如水稻，已经打破 RNA模板互补配对，以延伸端粒缩短的序列，保证 这一界限，其应用技术逐渐成熟[4]。在农杆菌侵染 端粒的正常长度，维持细胞内遗传物质的稳定性。 水稻愈伤组织时，培养基中需加入一定量的乙酰丁 端粒酶中的RNA成分包含一个短的模板序列 香酮(AS)，诱导外源基因的表达，同时拓宽可选择 (TER)，决定了端粒的重复合成序列[1]。在端粒酶 的农杆菌菌种范围[5。6]。研究选择农杆菌LBA4404 保持一定活性的情况下，端粒酶RNA模板基因序 菌种，通过转基因菌种与水稻愈伤组织共培养方法 列直接决定了延伸得到的端粒末端序列。由于植物 将基因整合到水稻基因组中。 基因组内端粒酶RNA模板为单基因，通过基因突 此外，转基因愈伤组织中端粒酶活性测定方法 变改变水稻端粒酶RNA模板基因序列可导致基因 的选择，对于正确评价实验的可靠性具有重要意义。 组端粒末端重复序列的改变，从而对端粒酶RNA 同时，由于端粒酶活性的检测也已经成为了现代肿 模板序列实施有效鉴定。 瘤恶性、良性判断的新指标[7’8]，有效的检测方法对 建立一套完备的端粒酶RNA模板基因序列鉴 其也具有一定指导意义。常用的检测方法主要有端 定体系还需要水稻转基因技术相辅助。研究表明， 粒重复序列延伸法和端粒重复序列扩增法(TRAP) 水稻转基因采用NB培养基更有利于水稻愈伤组织 及其改良方法。对于TRAP法进行改良的方法有 的诱导，预培养4～5d的水稻愈伤组织更利于形成 很多，如核素一TRAP法、银染TRAP法以及在其基 抗性愈伤阻3【。经过验证，水稻成熟胚与幼胚均可诱 础上建立的端粒酶延伸产物的液体闪烁计数法[9]。 导出质地较好的愈伤组织。基于水稻成熟胚取材便 另外，端粒酶活性检测中，引物的设计极其关键，因 d 捷，使用继代4次的水稻成熟胚愈伤组织预培养4 此，通过对其引物的研究也可以得到较好的改进方 可作为农杆菌侵染的材料。 法Do]。 收稿日期：2012一II--07 作者简介：杨力媛(1987一)，女，河北邢台人，硕士研究生，研究方向为端粒与端粒酶。 通信作者：刘4,JII．电子信箱：xcliu@zstu．edu．CFI 万方数据 第4期 杨力媛等：水稻端粒酶RNA模板基因序列鉴定体系的建立