包涵体的形成原由及其处理方法.pdfVIP

· 62 · 《上海畜牧兽医通讯》 2009年第 1期 包涵体的形成原因及其处理方法 邝爱丽 陈圆圆 彭志峰 郑鹿平 付仁一 徐 雪 郭伦涛 王川庆 (河南农业大学牧医工程学院 河南 郑州 450002) 20世纪 90年代以来 ，基 因重组技术得到很大 的发展 ，越 防止水解酶作用 的试剂 ，如酶 的抑制剂、EDTA(乙二胺 四乙 来越多的工程菌(或工程细胞)被构建。大肠杆菌表达系统 酸)。破菌的方法很多，主要包括以下几种：(1)渗透破碎法 ： 是 目前最常用的外源蛋 白表达系统 。大肠杆菌 由于遗传背 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。(2)冷热交替 景清楚，容易培养 以及有大量可供选择 的克隆载体与表达载 法 ：把待碎样品投人 90℃左右水 中维持数分钟后取出投入冰 体 ，使之成为人们克隆表达外源基 因的主要细菌 lJ。然而 ， 浴 内，可使大部分细胞破碎 。可用于提取蛋 白质和核酸 。 在实践过程中，一个十分棘手的问题是许多外源基因在大肠 (3)反复冻融法 ：把待碎样 品冷却到一2O℃，冻固后取 出，缓 杆菌、酵母等表达体系 中表达时，往往 以包涵体形式存在 ，高 慢解冻 ，如此反复操作 ，细胞 内液结冰膨胀而使细胞胀破导 效表达的重组蛋 白在细胞 内凝集 ，形成不溶 的、无活性 的固 致部分细胞及胞 内的颗粒破碎 ，但也可使生物活性物质失 体颗粒。一般含有 50 ％(质量分数)以上的重组蛋 白，其余 活 。这种方法虽简单方便 ，但对温度变化敏感的蛋 白质却不 为核糖体元件 、RNA聚合酶 、内毒素 、外膜 蛋 白、环状或缺 口 宜采用 。(4)超声波法 ：使用超声波仪使细胞膜上所受张力 的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为 0．5～1 m，具有 不均而使细胞破碎 。根据不 同待碎样品采用不 同频率 ，不同 很高的密度(约为 1．3mg／m1)，无定形，非水溶性，可溶于变 时间；另外，超声波处理时溶液温度升高会使不耐热的物质 性剂如尿素、盐酸胍等 。因此如何分离纯化这些工程菌所表 失活，因此使用时为防止温度升高，除间歇开机外 ，还需人工 达的重组蛋 白则是基因工程技术产业化所面临的重要问题 。 降温 。避免溶液 内存在气泡 ，这样会使蛋 白质变性 6【】。(5) 这一工艺过程复杂 ，需要较高的技术和先进 的设备条件 ，且 溶菌酶处理法 ：多用于破坏大肠杆菌等微生物 的细胞壁 。在 无 固定模式可以借鉴，主要靠经验和实践摸索 ，具有很高的 每毫升含 2亿个细胞 的悬液 中加 100 g至 1mg溶菌酶， 挑战性。 37℃保温 10min，或者室温作用 30min，细胞就破坏了。 1 包涵体形成的原因 2．2 洗涤 包涵 体 洗涤包涵体前先 8000r／rain，412离心 15rain，可使大多 (1)表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体， 数包涵体沉淀，与可溶性蛋 白分离。为了除去包涵体上粘附 表达量越高越容易形成包涵体L2]。原因可能是合成速度太 的杂质 ，如膜蛋 白或核酸 ，利用洗涤液洗涤包涵体沉淀，常用 快，以至于没有足够 的时间进行折叠，二硫键不能正确配对 ， 去污剂 Tritonx一100或脱氧胆酸钠和低浓度变性剂 (如 过多蛋白间的非特异性结合，蛋 白质无法达到足够的溶解度 2mol／L尿素或盐酸胍等)洗涤 以除去脂类，但过高浓度的尿 等。(2)重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋 白，真核糖蛋 白无法 素或盐酸胍会使包涵体溶解 【