黄喉拟水龟摩氏摩根菌的分离鉴定及致病性研究.pdfVIP

_圈 1垦塑旦夔 黄喉拟水龟 (Mauremysmutica)，两广地区俗称为 的PCR引物是Wi11iam等报道 的通用 引物对 fD1／ 石龟 ，分类上隶属爬行纲、龟鳖 目、龟科、拟水龟 rP2，弓I ，歹0为 ：fDl：5 一AGAGTTTGATccTGGcT— 属。在我国主要分布在长江以南、江苏、浙江以及台 CA6—3 、rP2：5-ACGGCTACCTTGTTACGACTT一3 。 由 湾等地，国外多产于越南、日本等地。黄喉拟水龟具 上海铂尚生物技术有限公司合成。 有较高的食用和药用价值，其肉质细嫩、营养丰富、 2．方 法 味道鲜美，具有滋阴补血功能。近年来，由于黄喉拟 (1)病原菌的分离纯化。洗净病龟的外壳，体表 水龟在市场上的需求量逐渐变大，因此养殖规模也随 用75％乙醇消毒后，无菌操作采集黄 喉拟水龟 的肝 着不断扩大，而养殖户又缺乏疫病防治知识，使得黄 脏 、肺脏划线接种于麦康凯平板和TSA平板上，置 喉拟水龟疾病 的流行 日趋严重，导致养殖户经济损 28℃恒温培养 18~24小时。分离单菌落，挑去相似 失。2011年8—9月，广东肇庆某养殖场养殖的黄喉 菌落，细菌经反复传代2～3次纯化后，转种于TSA培 拟水龟慢性发病，发病率约60％，死亡率达25％。病 养基和TBS平板上，28℃培养 18小时，分离出致病 龟主要症状表现为发病初期鼻孔和 口腔中常有大量 白 菌 。 色透 明泡沫状黏液流出，后期流出黄色黏稠状液体， (2)形态学观察。用培养 18小时的TSB培养物作 头颈常伸出体外，腹部的肪盾、肛盾乃至背甲前部会 革兰氏染色，在光镜下观察细菌的形态及染色特性。 出现溃疡而形成凹洞。病龟活动迟缓，不下水，拒食 (3)生化鉴定。病原菌理化特性鉴定参照 《水牛 或少食。排泄物呈稀脓乃至绿色或黄、白痢。剖检主 微生物学实验法》和 《一般细菌常用鉴定方法》，并 要是肝脏肿大呈煮熟样，周边有针尖大出血点，有的 按照 《常见细菌系统鉴定手册》鉴定到种。 肝脏稍有肿大；肺淤血、脓肿；肾脏有针尖大弥漫状 (4)分子生物学鉴定。取 1毫升培养好的菌液， 出血点；心尖充血 、出血，脾脏呈暗褐色；肠道空 按照革兰氏阴性菌提取试剂盒提取总DNA。PCR采用 虚，内容物不多。本研究从黄喉拟水龟的肝脏和肺中 50微升体系，在反应管中分别加入ExTaqTMDNA聚合 分离出摩根菌 ，并进行形态特征、生理生化鉴定和 酶0．25微升 ，10×ExTaqBuffer5微升，dNTPMix4 PeR鉴定研究，并对其进行致病性研究，以期为临床 微升，上、下游引物fD1、rP2各 1微升，模板DNA2 治疗提供参考依据。 微升 ，ddH036．75微升 ，置于PCR仪中进行扩增 。 一 、 材料和方法 反应程序为95℃5分钟、94℃6O秒、55℃60秒、72℃ 1．材料 2分钟进行30个循环，72℃延伸 10分钟。PCR产物于 (1)试验动物 。患病龟来 自广东肇庆某养龟场发 1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后按照胶回收试剂盒说明进行 病黄喉拟水龟，送到实验室进行细菌分离鉴定。试验 胶回收，连接至pMD18一T载体 ，转化E．coliDH5a感 用健康的黄喉拟水龟3O只，购 自广州动物市场，体 受态细胞，然后挑取阳性克隆送上海铂尚生物技术有 重20~40克。健康小白鼠30只，购 白南方医科大学 限公司测序 。 实验动