非接触式共培养体系对脐带间充质干细胞向类髓核细胞的诱导分化效应.pdfVIP

2011年 8月 ，第 9卷 第 4期 JSpinalSurg．August2011．Vol9．No4 的潜能，为椎间盘退变性疾病的生物学治疗探索一 1．2．3 细胞非接触式共培养 种新的细胞来源。 用带有插入层的Transwell6孔板进行非接触式 共培养，插入层具有高密度孔，孔径为0．4Ixm。上 1 材料与方法 层接种NPCs，6孔板底部接种UCMSCs，细胞比例为 1．1 材料 1：1，接种密度为 6．0×10／cm 。加入 DMEM／F12 1．1．1 主要材料和试剂 (10％FBS)培养基，于37~C、5％CO 培养箱中培养， DMEM／F12培养基 (Hyclone，美 国)，胰蛋 白酶 每2d或3d换液。单独培养的脐带问充质干细胞 (Solaibo)，PBS(Sigma，美国)，特级胎牛血清 (fetal 为对照组 。 bovinesenlm，FBS)(Gibco公司，美 国)，Transwell6 1．2．4 细胞总 RNA提取和 Rea1．TimePCR检测 孔培养板 (Corning，美国)；Rea1．TimePCR试剂盒购 取共培养 1周后的脐带间充质干细胞，采用标 于 日本 Takara公司，TrizolReagent试剂购于美国 准的Trizol溶液提取技术提取总RNA。弃上清，加 Invitrogen公司；引物 由北京博迈德公司合成。Real— 入 1mLTrizol，颠倒混匀，室温 5min，加入氯仿 TimePCR仪 (BIO-RADMJMinioptiondetectorfor 0．2mL，颠 倒 混 匀，室 温 静 置 5 min，4℃， PTC1148，美国)。 12000r／min离心 5min，吸取上层水相于 1．5mL 1．1．2 细胞来源 EP管中，加入等体积的异丙醇，混匀后室温放置 脐带取 自健康足月产新生儿；髓核组织取 自一 10min，4℃，12000r／min离心 10min，弃上清，加入 位25岁男性，该患者因创伤导致胸腰椎爆裂性骨折 冰预冷的75％乙醇 1mL，4℃，7500r／min离心 (T：～L)行脊柱融合。均经患者家属或本人知情 5rain，弃上清，空气干燥5～10rain，获得的RNA溶 同意。 于2O DEPC水中。紫外分光光度仪检测提取的 1．2 方法 RNA的纯度和浓度，OD260／OD280值应 1．8，将 1．2．1 人脐带间充质干细胞培养 提取的细胞总RNA置入．70~C冰箱保存。 无菌条件下切取足月产健康新生儿脐带约 取3IxLRNA模板，加入 1txL随机引物，1txL 30cm。在超净台中用平衡盐溶液洗去脐带残留血 AMV反转录酶，8 LdNTP，加入4 L缓冲液，3 L 液，将脐带剪成4cm大小节段，纵行剪开脐带外膜， DEPC水，使反应体系总体积为20 ，于42℃，反 游离2条脐动脉和 1条脐静脉，取血管之间以及血 转录 1h，获得 eDNA。逆转录后获得的eDNA通过 管与外膜之间的华通胶组织，剪切成约 1．0mm× Real—TimePCR对蛋 白多糖、Ⅱ型胶原、SOX9进行 1．0mm×1．0mm大小碎块，平衡盐溶液冲洗后，浸 扩增，引物序列根据文献报道合成 。管家基因 于0．2mg／mL的Ⅱ型胶原酶溶液中，置37~C恒温消 GAPDH作为内参，引物序列由Primer5．0软件生成： 化 18h，2500r／min离心10r