大黄鱼生长激素在毕赤酵母中的优化表达.pdfVIP

福州大学学报 自然科学版 . . 第 卷第 期 . 年 月 : : ? / .. . 文章编号: ? 一 大黄鱼生长激素在毕赤酵母中的优化表达 陈菁 ,生书晶 一,黄晓南。,刘树滔 ,饶平凡.福州大学生物科学与工程学院,福建福州 ; .华南理工大学生物科学与工程学院,广州 ; .福州市海洋与渔业技术中心,福建福州 摘要:尝试利用毕赤酵母的表达系统制备大黄鱼生长激素 ,,.根据 酵母偏好密码子设计优化的基因序列,通过化学方法合成基因,构建表达载体 ? ,利用化学 转化技术,将该基因整合到巴斯德毕赤酵母 一 菌株染色体上并得以成功表达,表达量达到? 一. 关键词:大黄鱼;生长激素;毕赤酵母;优化;表达 中图分类号: 文献标识码: , ? , , ? 。, ? , ? . , ,, ; . ,,, ; . ,,: . ,.? . 一 . ~.: ; ; ; ; 引言 作为我国最具特色的海产经济鱼种之一的大黄鱼?,人工养殖成为目前市场大黄鱼的主要来源.但 其人工养殖存在成本高、风险大等弊端.鱼生长激素具有增强鱼的食欲并提高饲料的转化率 ,促进鱼体 的生长发育,加速蛋白质的合成与脂类的降解 .可望用于解决大黄鱼养殖中存在的生长周期长、饲料 利用率低等养殖成本高的问题.因此在鱼类的水产养殖领域有重大的应用价值,日益引起人们的关注.目 前,已有多种鱼类的生长激素被分离、纯化和表达,且等同于天然 的生物活性,通过投喂鱼类显示较 强的促生长作用 .较之天然的鱼类生长激素,基因工程制备的 具有操作简单、成本低且产量高等 优点,易于实现产业化,在水产养殖中具有广阔的应用前景. 虽然在大肠杆菌中成功实现了胞内表达 ,但作为高效的真核表达系统,毕赤酵母不仅表达量 高、可高密度发酵培养,且营养要求低、生长快.此外,表达系统能够进行翻译后二硫键的形成和糖基化 等加工修饰,并有助于形成正确的空间结构 ,具有操作简洁、表达产率高、产物分泌表达以及发酵工艺 成熟等优点.有利于简化后续的产物提纯工序,节约生产成本,且由于能将外源蛋白分泌到胞外,减轻外 源蛋白的累积对细胞造成的干扰,有利于高水平的表达.为了保证 的高效表达,本研究还采用酵母 偏好的高频率密码子,密码子的相对使用度 大于. 的达到 %,并将 含量控制在 %一 % 收稿日期:一 ? 通讯作者:陈菁一 ,助理实验师. ? : . 基金项目:南昌大学食品科学教育部重点实验室开放基金资助项目福州大学学报 自然科学版 第 卷 之间 ,据此对全基因序列进行优化合成,成功构筑毕赤酵母胞外分泌的工程菌,甲醇诱导高效表达获得 了大黄鱼生长激素. 材料与方法 . 材料 毕赤酵母菌株 . 一 、大肠杆菌 和质粒 本实验室保存; ,,,胁 ,,, 一, , 等购 自上海 生物工程公司或 生物工程公司; ,等购自英国 公司;. 抗生素购自美国 公司;琼脂糖胶回收试剂盒购于 公司;其它均为国产分析纯试剂. . 方法 . . 全基因优化合成 根据赵翔等对 . 密码子用法分析结果 ,利用 . 软件分析 基因密码子组 成及分布,通过基因全合成的方式合成为酵母密码子偏好性的 基因,同义密码子相对使用度? , 大于. .合成基因包括 的 成熟肽核酸序列,上下游 /酶切位点, 、 两个碱性氨基酸的密码子,一个终止密码子,并将 含量控制在 %一 %之间.委托上海 生物工程技术服务有限公司合成优化的全基因序列,并将其插人 Ⅱ穿梭质粒中,设计的基因序列如下: 垒:::::: 划线部分是 的全基因序列 . . . 表达质粒? 的构建 目的基因以及质粒的酶切、回收、连接、感受态的制备、转化大肠杆菌以及克隆子的鉴定,方法 参见参考文献 . 根据 编码序列及克隆和检测的需要,设计相应的上、下游引物.上游引物 : ’?’ 下划线为 酶切 下游引物 : ’ ’ 下划线为酶切位点,为了使蛋白融合表达下游的 标签,在添加一个 酶切位点后未添 加终止密码子 .引物合成以及阳性克隆子的测序委托上海 生物工程技术服务有限公司. . . 毕赤酵母的转化、鉴定 用内切酶 单酶切线性化处理阳性克隆子的质粒, 的方法转入感受态的 . 一. 转化子通过抗生素 抗性筛选的方法获得阳性克隆.以抽提的阳性克隆菌体基因组为模板进行 分析进一步确定筛选的 . / 中含有大黄鱼生长激素的基因. . . 大黄鱼生长激素的诱导表达、分析 将工程菌株 ? / 一 接种在 含 的 培养基中摇培过夜 ,,按照 %接种量扩培,待 鲫达到 . 时,加人甲醇至终浓度为 . %,以后每 隔 补加甲醇至终浓度为 . %,连续诱导 .按时间点分别取 菌液样品,离心收集上清和菌