H5N1禽流感病毒微磁粒捕捉系统和SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立.pdfVIP

1l44 中国兽 医学报 2009年9月 第29卷 第9期 ChinJVetSciSep．2009 Vo1．29 No．9 H5N1禽流感病毒微磁粒捕捉系统和 SYBRGreen I荧光定量 RT—PCR检测方法的建立 张 坤 。，李 刚 ”，贾凤芹 (1．中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100093；2．西南大学 动物科技 学院，重庆 400715；3．动物营养学 国家重点实验室 ，北京 100093) 摘要 ：利用禽流感 H1N1抗体包被微磁珠制备免疫磁珠，再通过抗原抗体反应得到了含有 Nl亚型的病毒 ，然后设 计针对 H5亚型的特异性引物 ，同时构建含有 H5亚型 HA基 因部分序列的标准质粒 ，定量后作为模板 ，建立 了可 以检测H5亚型禽流感病毒的SYBRGreenI荧光定量 RTPCR (RRT—PCR)方法。结果表明，制备的免疫磁珠可 以吸附4个血凝单位的H5Nl流感病毒和 5个血凝单位的H1N1流感病毒 ，而对 H9N2亚型流感病毒无特畀性结 合 ，从而可 以富集 N1亚型的流感病毒。H5亚型RRT—PCR检测灵敏度可达到 4．6拷贝／IA ，线性范围达 5个数量 级；特异性强，与NDV和 H1、H9亚型禽流感病毒不发生交叉反应 。因此 ，利用该方法可以很好地检测 H5N1禽流 感病毒。 关键词 ：H5N1禽流感病毒 ；微磁粒捕捉系统 ；荧光定量 RTPCR 中图分类号：$852．65；R535 文献标识码 ：A 文章编号：1005—4545(2009)09—114405 Developmentofmagneticbeadcapturesystem andSYBRGreen IrealtimeRT_ PCR techniquefordetectionofavian influenzaA (H5N1)virus ZHANGKun～，LIGang “，JIAFengqin (1．BeijingInstituteofAnimalSciem’eandVeterinary Medicine。ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100093，China；2．CollegeofAnimal Scienceand Technology，SouthwestUniversity，Chongqing400715，China；3．StateKey Laboratory 0厂AnimalNutrition，Beiing 100093，China) Abstract：Thevirusarecapturedusingnewlyestablishedmagneticbeadswhicharecoatedbyanti—H 1N1anti— bodies．Usingthismethod，theviruswasconcentrated．A pairofprimerswasdesignedinsubtypeH5AIV HA gene conservativeregion．M eanwhile，thestandardplasmidcontainingpartialsequenceofsubtypeH5AlV HA genewas constructedasatemplate。aSYBRGreen I realtimeRTPCRwasestablished．Theresultsshowedmagneticbeads couldabsorbfourHA unitsofAIV (H5N1)andfive HA unitsofAIV (H1N1)，butdid notbind withA1V (HgN2)．DependingontheenrichmentofsubtypeN1AIV ，theRRT PCR fordetectingAIV H5subtypeshowedthe sensitivitywKs4．6copies／g[，whileitwashnearwith5logdynamicrang．Thespecificityassayshoweditisofhigh specificity，withnocrossreactiontoNDV ，H1andH9AIV．Sothismethod，magneticbeadcapturesystem andSYBR Green Irealti