南极衣藻（Chlamydomonas sp.ICE-L）谷胱甘肽还原酶基因的原核表达及其条件优化.pdfVIP

第 42卷 第 6期 海 洋 与 湖 沼 VO1．42．No．6 2011年 11月 0CEAN0L0GIA ET LIMNOLOGIA SINICA NOV．，2011 南极衣藻(Chlamydomonassp．ICE—L)谷胱 甘肽还原酶基因的原核表达及其条件优化木 刘 莹 丁 炳 ① 简纪常 吴灶和 缪锦来2 f1．广东海洋大学水产学院 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室 湛江 524025； 2．国家海洋局第一海洋研究所 海洋生物活性物质重点实验室 青岛 266061) 提要 采用 RT-PCR技术克隆南极衣藻 GR基因ORF全长 cDNA，然后经酶切、连接等步骤构建 其原核表达载体；并对其表达的诱导时间、IPTG浓度、温度进行 了优化，以期获得较大量的酶蛋 白。 结果表明，将构建的原核表达载体 pET-GR导入大肠杆菌 BL21，可以高效表达融合蛋 白；且表达的 蛋 白均以包涵体的形式存在；经SDS．PAGE电泳结果显示，获得的目的蛋 白分子量为52．2kDa，符合 预期分子量；GR蛋 白在大肠杆菌中诱导表达优化条件为，1．0mmol／L的IPTG,28。C诱导3h。这些结果 为进一步深入研究该基因的特性与功能奠定了基础。 关键词 南极衣藻Chlamydomonassp．ICE—L，谷胱甘肽还原酶，原核表达，诱导条件，冰藻 中图分类号 Q936，Q78 谷胱甘肽还原酶(glutathionereductase，GR)是谷 应机制。 胱甘肽抗氧化系统 的主要酶之一，广泛存在于各种 1 材料与方法 生物 。改变 GR的活性和表达能引起生物 明显的生理 变化，通过 GR 的遗传转化来提高其表达，在抗逆遗 1．1 藻种与培养基 传育种中具有较大 的应用前景。 本实验所用南极冰藻——衣藻 (Chlamydomonas 严酷 的极地环境造就了南极生物特殊 的生物学 sp．ICE．L)，由国家海洋局第一海洋研究所海洋生物 特征，它们可能通过分子水平上 的改变，而引起组成 活性物质重点实验室提供。其培养液采用 Provasoli 和生化成分含量 的改变，以适应严酷 的极地环境 (丁 培养基 (Provasoli，1968)。 炳等，2006；李江等，2010)。极地微藻具备一套有效的 1．2 质粒与受体菌 抗胁迫体系保护 自身的光合系统、生物膜系统和酶系 质粒载体：pET-2la，由本项 目组保存。 统，以保证微藻细胞在极端条件下生理活动正常进 受体菌：大肠杆菌菌株 DH5ot；大肠杆菌菌株 行。GR在南极冰藻适应极端环境 中(低温 、重金属等) BL21(DE3)由本项 目组保存。 具有重要的地位 (Dingetal，2005；丁炳等，2006)。本 1．3 主要工具酶及试剂盒 研究在前期南极衣藻Chlamydomonassp．ICE—L谷胱 dNTPs、ExTaq酶、rTaq酶、ReverseTranscriptase 甘肽还原酶的分离纯化与基因克隆的基础 [-_(Dinget M．MLV(RnaseH)、限制性核酸 内切酶NdeI和XhoI、 al,2007)，构建其原核表达载体，并转人大肠杆菌中 T连接酶、DNAMarker、蛋 白质分子量标准等均购 进行表达，优化其表达条件。期望为大量获取酶蛋白 白 TaKaRa公司；异丙基．B—D一硫代半乳糖苷 (IPTG) 进一步研究该酶的理化性质及其应用奠定技术基础， 购 自上海生工：PCR纯化试剂 QIAquickTMPCRPuri— 并从分子水平进一步了解极地生物对极端环境的适 ficationKit盒购 自QIAGEN公司；Trizol试剂购 自