酶活测定系统条件的确定.pdfVIP

Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. 酶活测定系统条件的确定 张沙沙 王栋 （北京中农博特生物工程技术有限公司 北京101121 摘要： 试验旨在研究在用DNS法测定酶活的影响因素，包括波长、反应时间、DNS显色时间、 底物浓度、标准曲线制作、稀释倍数等因素对酶活测定的影响，从而确定酶活测定的最佳的 反应条件，从而为酶活测定的标准化，流程化提供依据。 关键词：酶活、标准、酶活测定 影响酶活测定的因素很多,除了温度和pH 值以外, 本研究利用分光光度计从底物浓度、 酶促反应时间、DNS 显色时间、最适波长、标准曲线绘制等方面，测定几种常见饲用酶制 剂包括木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、α-淀粉酶、甘露聚糖酶、果胶酶、蛋白酶共7 种酶的活性，讨论这些因素对酶活测定的影响，并提出了比较可行的饲料用酶制剂活力测定 的分析方法。 温度、pH 值选用动物肠道相一致的40℃，5.5。 1 最适波长的确定 测定还原糖含量时波长的选择对测定结果的可靠性至关重要，从480nm到550nm均有采 用，常见的波长有490nm、520nm、540nm、550nm等，波长不同测得的A值也不同。因此， 测定酶活应先确定所用的最佳波长。研究表明，还原糖与DNS显色后在490nm处有最大吸光 值，在比色分析时一般选定最大光吸收值作为测定波长，这样做可获得最大的灵敏度。但在 实际测定过程中发现，使用722型可见分光光度计选用较短波长490-520nm，特别是当反应 液中还原糖含量稍大时，仪器读数跳动的很大，稳定性差，其标准曲线的r值偏离1的数值 趋大。随着波长的增大，A值变小，虽然测得的数据稳定性好，但灵敏度偏低，综合考虑， 选用540nm作为测定波长是比较合适的，这样既能获得较高的灵敏度，又可达到较佳的重复 性，从而提高测定的准确性。 2 酶促反应时间的确定 表1酶促反应时间与酶活测定结果的关系 反应时间（t ）稀释倍数 吸光度值540nm 企标酶活（u/g ）换算成国标酶活（U/g) 5min 5000倍 0.196 2.04*105 1358 10min 5000倍 0.309 1.4*105 932.09 20min 5000倍 0.461 9.57*104 637.15 30min 5000倍 0.626 8.236*104 548.34 注：DNS 显色时间为10min 从上表1看出酶促反应时间越长，吸光度值慢慢增大，但是计算时要将反应时间整除， 且反应时间长酶本身的活性也会丧失一部分，因此反应时间短的样本酶活反而更大，5min 的国际酶活几乎是30min 的3倍。 3DNS 显色时间的确定 如表2 所示，随着显色时间的延长，吸光度值没有显著变化。显色时间，5min 即可， DNS 的显色时间对酶活测定的结果没有明显的影响。 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. 表2DNS显色时间与酶活测定结果的关系 显色时间（t ）稀释倍数 吸光度值540nm 5min 5000倍 0.250 10min 5000倍