大鼠抗—HRP单克隆抗体的制备及应用的研究.pdfVIP

维普资讯 第 21卷 第4期 解 剖 学 报 V01．21．No．4 19g0 年10月 ACTA ANATOM ICA SINICA Oct． 1990 大鼠抗一HRP单克隆抗体的制备 ‘ 及应用的研究 孙索莲 赵丽纯 刘晓兰 (北京市肿瘤防沿研究所，北京 10~034) 摘要 本文采用大鼠杂交瘤体系制备了大 鼠抗HRPMcAb，并以此与 HRPfli0成 McPAP复 合物。本文的结果表 明，我们制成的McPAP复音物不仅可用于免疫组织化学法 ，也可用于 ELISA 法。均获得强的染色反应而背景清晰，并对 McPAP与酶标记抗体的灵敏度进行了比较。 关键词 大鼠杂交瘤 大鼠抗 HRP单克艟抗体 大鼠McPAP 酶联免疫吸附实验 免疫组 织化学实验 在制备单克隆抗体 (McAb)的研究中，国外已证实大鼠杂交瘤体 系具有优于小鼠体系 的某些特点 】。作者首先引进了大鼠杂交瘤技术 ，并建成了我国自己的完整技术体系。该 体系已经引起很多科学工作者的关注和兴趣，并开始推广应用。 大鼠体系建立和推广使用后，最迫切需要的是抗大 鼠IgG抗体及其与HRP的 交联物等 公用试剂。大 鼠的单克隆抗体 PAP (McPAP)的制备在 国内尚未见报道 。为此作者制备了 大 鼠抗HRPMcAb，并以其与HRP制成McPAP。本文报道大 鼠McPAP的 制备方法及初 步应用的结果。 材料与方法 一 、 试剂与溶液的配制 兔抗大 鼠IgG(RArG)，HRP标记兔抗大 鼠IgG(HRP—RArG)，大 鼠抗 胃癌 McAb(皆 为本实验室制备)。HRP：VI型，RZ3．03 (上海生物化学研究所)。封 闭液：0．1g明胶， 1g牛血清 白蛋 白溶于 0．01mol／L，pn7．2的PBS (下周)100ml；枸橼酸缓冲液；枸橼酸 1．05g，磷酸氢二钠 3．58g溶于双蒸水 150ml，0．05Yo戊二 醛 固定 液：1ml25 戊二醛加 500mlPBS。终止液：1．25ml浓H2s0 加 8．75ml枸橼酸缓冲液。洗液：Tweer~200．1ml 加 PBS200ml。 二 、胃癌细胞系 BGC823 (北京医科大学附属人民医院建立)。 三 、抗HRPMeAb制备 采用大鼠一大鼠杂交瘤技术获得 6株分泌抗 HRPMcAb的杂交瘤株，择 优选其 中3株 进行分析，并用以制备大 鼠McPAP。 四、大鼠 MePAP的制备 将 HRP／抗 HRPMcAb IgG按克分子量计算 ，以 1：1、2：I、4：1、8：1的比例 制 备大 鼠McPAP。在最终体积 2ml的PBS中加入含 1nagIgG的大鼠抗 HRPMcAb腹水及不等 维普资讯 期 孙素莲等．大鼠抗 HRP驻克隆抗体的制各及应用的研究 量的HRP (0．25、0．50、】00、2．00mg，室温下轻轻搅拌 30分钟或 充 分混匀．4。c冰箱 过夜即可使用。在 1mgIgG的McAb中加入 05～1mgHRP为宜。 五、大鼠MePAP与 HRP-RArG用于 ELISA 的灵敏度比较 用 BGC823细胞 (5×10j／m1)包被 g6孔培养板，50 l／孔，37。C，5％COz培 养箱中 过夜使细胞充分贴壁 ，弃培养液，PBS洗 1次，0．05％戊二醛 固定 10~15分钟，PBS洗 3 次，封 闭液阻断非特异性吸附后，洗液洗 2次，加入第一抗体 (大 鼠抗 胃癌McAb培养上清 液)，37。C，45分钟 ，洗 液 洗 3次 ，在 PAP法 中加 RArG血清 (用 PBS1：1000稀释)， 501／孔，37℃ 45分钟，洗 3次，然后加入 1、0．5、0．25、0．125、0．062和 0．031ttg／ml不 同浓度的McPAP (以 IgG含量计算)50p．1／孔， 间接 免 疫