酶消化的人羊膜基膜对鸡胚前脑神经细胞生长的影响.pdfVIP

维普资讯 第 21卷 第 1期 解 刨 学 报 VoI 21．N 0 1 1990年 1月 ACTA ANAToM ICA SINICA Jan． i990 f ／ 酶消化的人羊膜基膜对鸡胚前脑 神经细胞生长的影响 周明华 赵丽萍 (香港大学医学院解剖学系 摘要 本研究采用肝素酶 I、II、肢原酶和软骨素酶 ABC消化的人羊膜基膜 (HABM)作为 支 持物．研究对前脑神经细胞的生长支持作用 包被HABM 的24孔培养板 ，首先用 酶 37。C消化 1 小时 ，然后以RPMI1640加 6 小牛血清(含 20mmol／I HEPES)作为培养液，培养神 经 细 胞 20小时，以搬量 自动比色法定量神经细胞盼生长。微量 自动比色珐是利用四唑盐 (MTT)可教藩细 孢嗳收并转变成 甲厝产物的原理 ，以ELISA仪测光密度(oD)值 以显示藩细胞数量。结果表明， 肝寨酶 I，肢原酶和软骨素酶 ABC明显减少 HABM 上神经细胞的粘附 ，而肝 寨 酶 II明显 增 加 HABM 上神经细胞的粘附，井促进神经细胞的生长和存活。 关曩词 神经细胞 人羊膜基膜 肝素酶 酶消化 MTT微量 自动比色珐 人羊膜基膜(HABM)做为神经生长支持物支持神经元在体内和体 外生 长 ， 已得 到证 实…。基板蛋I~(1aminin，LN)是HABM 中的主要促神经生长因子。最近的研究发现，硫 酸肝素糖蛋 自在神经纤维生长和粘附上，有不可忽视的作用…。本文分别采用 肝 素 酶 I、I (heparinascIII)、胶 原 酶 (collagenas~)和 软 骨 素酶 ABC (chondroitinas~ABC)消 化 HABM， 目的是探讨 HABM 中的各种成分对神经细胞生长的影响。 材料和方法 (一)HABM 的制备 】：新鲜人胎盘，无菌条件下分离羊膜，以PBS洗 2次，后 漫在 Imol／LNHOH 内，室温 1小时。在解剖镜 下，以带胶手套的手指，轻轻拭去上皮细 胞，再 以 PBS洗 3次 ，保存在 4~CPBS内。使用时剪成 1×1cm ，贴在包被了多聚鸟氨酸 的 24孔 培养板上，紫外线灭菌，干燥后备用。制备好的HABM 支持物，分别加入肝素酶 I(5u／ml， 0．1mol／L醋酸缓冲液，pH7．0)100 l／孔，37。c消化基膜 1小时 肝素酶 Ⅱ和胶 原酶用量 及方法同上；软骨素酶ABC(1u／ml，0．25mol／LTris缓冲 液，pH8．0)100 1／孔，37。C 消化 1小时(上述 4种酶均为Sigma产品)。最后 以RPMI1640洗 3次备 用 l5]。 (--)神经细胞的制备 】：8天鸡胚 3只，无菌条件下分离前脑，剥离脑膜，将 前 脑 切 成 8块，0．08 胰酶 37。C消化 30分钟，用含 1％牛血清 白蛋 白的L—EBM 培养 渍 洗 3次， 后以吸管吹打 20次即成单细胞悬液。此方法每次可得到5×10个前脑神经细胞 。实验 重 复 4次，共用 12只鸡胚 。细胞分别以10，2×tO．4×10：、8x10和 16×10个的密度培养在HABM 包被的 24孔培养板上。最后选择 4×l0／孔的密度将细胞培养在经各种酶消化的 HABM支持 物上，用未经消化的HABM 孔做为对照。培养液为RPMI1640加 6％小牛血清，每孔培 养 第 四军医大学组织学胚胎学教研室，由京港学术交流 ·资助 奉研究由香港太学 ，陈蕉琴和医学研究基金资助 维普资讯 解 液量为 0．6ml。8天鸡胚 前脑按此方珐分离出的垒部是神经细胞，选在Bennett[与作 者 平雎 Varon的工作 (未发表资料)中均得到了证 实