培养中E8鸡胚前脑5—羟色胺免疫反应神细胞的鉴定.pdfVIP

维普资讯 筹2l卷 第 4期 解 剖 学 报 Vo1．21。No．4 1990年l0月 ACTA ANATOM ICA SINICA oct 1g90 培养中E8鸡胚前脑5一羟色胺免疫反 应神经细胞的鉴定 周明华 赵丽萍 张丽雯 (香港 ：学医学院鲁}剖学系) 摘要 本研究采用免疫细胞化学 PAP方法 ，对培养4天的E。鸡胚前脑 5一羟色胺 (5一rlT) 免疫反应神经细胞的表达进行研究。发现生长在基板蛋白 (LN)支持物上的前脑细胞，98％为糌 经特异性烯醇酶(NSE)免疫反应阳性细胞，证明为神经细胞j其中部分神经细胞显示 5一HT免疫 厦应强阳性 ，约占培养神经细胞的 10．4 ，大多数细胞为多突或双极的形态学特征。为了要了解 其余 2 的NSE免疫反应阴性细胞是否为胶质细胞 ，我们以胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体做胶 质细胞特异性染色 ，阳性细胞为 2 ，与上述结果一致 关麓饲 5一羟也胺免疫反应神经元 神经细胞培养 神经特异性烯醇酶 免疫细胞化学 鸡肛 目前的研究已经证实，单胺类神经元是种系发生上神经系统内最早 出现 的神 经细 胞 群…。5一HT作为神经介质存在于多种成年动物的中枢神经系统内。，。Parnav~Ias和ca— vanaght的研究表 明，5-HT在作为神经介质之前，对神经系统的发育起营养和诱 向作用 培养中的神经细胞在发育早期对 5一HT的表达 目前未见报道，本研究征实培养4天的E8鸡 胚前脑神经细胞部分为 5一HT免疫反应强阳性 材料和方法 一 、 培养支持物的制备 整个实验采用 24孔培养板。培养板内放置 1x1cm盖玻片，每个孔内加 0．2mI多聚 鸟氨酸 (PO0．1mg／ml，0．05mo1]L硼酸盐缓冲液 ，FH8．4)，置于室温下 1小时，暖出PO 后以PBS洗 2次 ，每个孔再加 0．3ml基板蛋 白(LN)(0．1~g／ml，PBS，pH7．4)，将培养板 放在 CO。孵箱内过夜 (37。C)。包被了LN的培养板，可用塑料袋密封，一20。c保存 ，使用前 将培养板温育30分钟，吸出LN后加入培养液使用。 = ，细 的分离培养 5只E8鸡胚，无菌条件下分离前脑，剥离脑膜 ，以o．08 胰蛋 白酶 37。C条件下消化前 脑组织 30分钟，以含 1 小牛血清 白蛋白的Eagle基本培养渡 (L—EBM)洗 3次 ，然后以吸 管吹打翩成单细胞悬液 镜下计数后，以4×l0／孔的密度将细胞培养在包被 LN的24孔培 养板上，培养液为 RPMI1640(含6 小牛血清和 20mmol／LHEPES)，培养4天后按 PAP 免疫细胞化学法染色。 三、染色过程 培养4天的鸡胚前脑细胞，以PBS(0．01mol／L，pH7．2)洗 2次，各 l0分钟；后以4 丰哥f究由CroucherFotmdation 香港大学和医学院研究基盘资助 维普资讯 4期 周 明华等．培养 中E8鸡胚前脑 5羟色胺免疫反应神经细胞的鉴定 多聚甲醛一0．2％戊二醛室温固定 1小时；PBS洗2次后加0．3 TritonX—l00处理30分钟， PBS洗 2次；再用 1：30正常羊血清处理 30分钟-然后分别以兔抗 NSE抗体 (1：200，Penin— sulaLaboratories，美国)，兔抗胶质纤维酸性蛋 白(GFAP)抗体 (1：300，Dakopatts，丹麦) 和 5-HT抗血清 (1：i000，第四军医大学组织胚胎学教研室制备)染色，4oC孵育 8小 时。 PBS洗 2次后 ，加入羊抗兔抗体室温 1小时，用 PBS漂洗 ，然后人 PAP(1：Z50) (Dakopa— tts，丹麦)室温孵育 1小时，用Tris一缓冲液漂洗，DAB显色。蒸馏水 中止反应 。按常规脱水， 透 明和封片，以PBS分