单克隆抗体技术及其在农业中的应用学生.pptVIP

* 单克隆抗体技术及其在农业中的应用 学生：袁 秋 华 导师：顾蕴洁教授 王 忠教授 单 克 隆 抗 体 多 克 隆 抗 体 抗体一般可分为三类 抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。 基 因 工 程 抗 体 抗体一般结构 常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由 多 克 隆 抗 体 不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。 多 抗 的 制 备 人源单抗的生产在技术上难以克服融合率低、建株难、不稳定、产量低、人体不能随意免疫等问题。随着基因工程技术的崛起以及抗体分子遗传学的深入研究，应用基因工程技术改造现有优良的鼠单抗的基因，其着眼点在于尽量减少抗体中的鼠源成分，但又尽量保留原有的抗体特异性，从而创造出新型抗体-基因工程抗体。 基因工程抗体 基因工程抗体种类 单 克 隆 抗 体 1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞地单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody），简称单抗. 单抗制备的基本原理 细胞内有两条DNA合成途径 主要途径——由糖、氨基酸合成核苷酸，继而合成DNA。此条途径可因加入叶酸拮抗物—氨基喋呤（A）或氨丝氨酸阻断嘌呤和嘧啶的生物合成而被切断。 次要途径 ——（应激或饥饿时才起作用）利用次黄嘌呤合成嘌呤核苷酸所必需的次黄嘌呤－鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT，H）及合成嘧啶核苷酸所必需的胸腺嘧啶核苷激酶（TK，T）合成DNA。缺乏其中之一就不能合成DNA。 单 抗 的 制 备 流 程 单抗的大规模制备 获得稳定的杂交瘤细胞系后，即可根据需要大量生产单抗，以用于不同目的。目前大量制备单抗的方法主要有两大系统，一是动物体内生产法，这是国内外实验室所广泛采用；另一是体外培养法。 迄今为止，通常情况下均采用动物体内生产单抗的方法，鉴于绝大多数动物用杂交瘤均由BALB/c小鼠的骨髓瘤细胞与同品系的脾细胞融合而得，因此使用的动物当然首选BALB/c小鼠。本方法即将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，因而可得到大量的腹水单抗且抗体浓度很高。可见该法操作简便、经济，不过，腹水中常混有小鼠的各种杂蛋白（包括Ig），因此在很多情况下要提纯后才能使用，而且还有污染动物病毒的危险，故而最好用SPF级小鼠。 体内生产单抗的方法 腹腔接种降植烷或液体石蜡，每只小鼠0.3-0.5ml 7-10天后腹腔接种用PBS或无血清培养基 稀释的杂交瘤细胞，每只小鼠5×105/0.2ml。 5天后，每天观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显 膨大，即可用16号针头采集腹水，一般可采2-3次 将腹水离心（2000r/min 5分钟），收集上清， 测定抗体效价，分装，-70℃冻存备用，或冻干保存 体内生产单抗的具体操作 单抗与多抗的比较 缺点 优点 针对多个抗原 纯度不高 专一性不强 重复性较好 每次都要从动物血清中提取 识别的适应性宽， 制备价格相对较低 多抗 获得高效价的单抗往往需要耗费较多的人力物力与时间，因此其价格也较高 ,适应性窄 针对单一抗原 纯度高 专一性强 重复性好 能持续地无限量体外繁殖 单抗 (1)测定不同来源抗原(Rubisco)含量 由于各种作物Rubisco的同源性极高，因此可利用小麦的Rubisco单抗测定其他作物的Rubisco的含量，并结合不同作物的光合效率，找出其相关性。 单克隆抗体在农业中的应用 单克隆抗体在农业中的应用 (2)防止作物某些病害 钟藏文等利用单抗技术制备了水稻细菌性条斑病菌的单克隆抗体；张成良、朱华等对烟草花叶病毒抗原决定簇和水稻白叶枯病菌血清型进行了研究；刘鹏等利用这一技术也制备出了棉花黄萎病菌的单克隆抗体；陈京等制备了番茄环斑病毒的单克隆抗体;林福呈等制备了稻瘟病菌单克隆抗体；于翠等制备了番茄花叶病毒的单克 隆