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易错 PCR技术改造扩展青霉脂肪酶 施碧红 ，李强 ，陈明 ，吴伟斌 ，施巧琴 ，吴松刚 1(福建师范大学教育部工业微生物工程研究中心，福建 福州 ，350108) 2(福建师范大学生命科学学院，福建 福州 ，350108) 摘 要 利用易错PCR技术，建立脂肪酶基因随机突变文库，将随机突变脂肪酶基因转化毕赤酵母 GS115，初步 筛选 了4000株突变菌株 ，对 300株较优突变株进行酶的活力、耐热性、耐酸性的摇管复筛，进一步摇瓶复筛后获 得优 良突变株 ep3，所产突变脂肪酶(ep3-GS)的适宜 pH为 9．4，适宜作用温度为35~C，与野生重组脂肪酶(PEL- GS)一致 ，该温度下酶 的比活为 3440U／mg，比野生型脂肪酶提高 17％。 关键词 易错 PCR，改造 ，扩展青霉，脂肪酶 微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的一个重要来源 。 活力分别为 30％和 10％，而野生型在此条件下均失 工业催化上要求脂肪酶具有高的活性 、稳定性以及对 去活性 ，突变体的耐热性大大提高。 底物 的特 异性 。扩展青霉 (Penicillium expansum) ． 本研究利用易错 PCR技术对扩展青霉脂肪酶基 FS1884所产碱性脂肪酶是国产商品化的碱性脂肪酶 因进行随机突变 ，建立随机突变文库 ，通过高通量筛 制剂 ，已被用于洗涤 、面包加工、皮革脱脂、鱼类脱脂 选 ，期望获得脂肪酶耐热性和酶活力都有所提高的突 等领域。但实际应用 中仍需进一步提高该脂肪酶的 变株。 热稳定性和酶活力。扩展青霉 FS1884是经过 20多 1 材料和方法 代物理化学诱变后的高产突变株 ，对各种物理化学诱 变剂 已产生一定的饱和效应 ，用传统 的诱变技术进一 1．1 材料 步改善其所产脂肪酶的性质或提高酶活 已出现困难。 1．1．1 菌株和质粒 且传统的诱变育种方法具有筛选工作量大、突变体遗 PichiapastorisGS115、pPIC3．5K，由福建师范大 传背景不清楚等缺点。易错 PCR(error—pronePCR) 学林琳教授提供 ，E．coliJM109由本实验室保存 。 技术直接对 目标蛋白质的编码序列进行随机突变 ，进 pPIC3．5k—PEL为本实验室构建并保存 ，PEL为 而定 向筛选理想性状的蛋 白质 ，为改 良目标蛋 白及解 Penicilliumexpansumlipase的缩写 (下同)。 析蛋 白质的结构与功能关系提供快捷途径。大肠杆 1．1．2 培养基 菌中，高丝氨酸 一琥珀酰转移酶 (MetA)是 甲硫氨酸 LB、YPD、MD、BMGY、BMMY、MM均根据 invitro- 合成途径中第 1个关键酶 ，该酶使其无法适应高温的 gen公司 Multi—CopyPichiaExpressionKit说 明配制 ， 生长环境 ，Mordukhova¨ 通过 易错 PCR技术 ，筛选 OMM平板为 MM 平板加上 2．5％橄榄油乳化液 ，橄 到了 1株 MetA的突变株 ，其中有 5个氨基酸发生了 榄油检验板为含有 2．5％橄榄油乳化液的琼脂板。 突变 ：S61T，E213V，I229T，N267D和 N271K，使其 1．1．3 引物 能在更高的温度下 (44~C)生长。Niu 等通过定 向 引物 P1，P2用于从 pPIC3．5K—PEL质粒上扩增 进化 (易错 PCR和 DNAShuffling结合)的研究方法 ， 脂肪酶 (PEL)基 因，其设计原理见参考文献 ： 建立 Rhizopusarrhizus脂肪酶随机突变文库 ，筛选到 1 P1：5CGClGGATccl ATGTTGTTCAACTAC 株最适作用温度提高 10％的突变株 ，且突变株在