表达猪CD3 ε蛋白重组腺病毒的构建及免疫原性测定.pdfVIP

维普资讯 中国兽医杂志 2008年 (第 44卷)第 6期 17 表达猪 CD3￡蛋 白重组腺病毒 的构建及免疫原性测定 孙 栋 ，郭 鑫 ，杨汉春 ，陈艳红 ，查振林 (中国农业大学 农业部预防兽 医学重 点实验室 ，北京 海淀 100193) 中图分类号：Q789 文献标识码 ：B 文章编号：0529—6005(2008)06—0017—02 CD3分子是 T细胞重要 的表面分子 ，表达于成 TTCAGG-3，用于巢式 PCR方法扩增猪 CD3~完整 熟 T细胞表面 ，与 TCR组成 TCR—CD3复合物 ，在 蛋白基因(包括信号肽、成熟肽)，阴影部分为上 、下游 T细胞 的分化增殖 以及 功能方 面有着重要 的作用 。 引物中加入的HindⅢ、Sal工酶切位点。 自1979年 Kung等H]首次制备 了抗人类 CD3单克 采集猪抗凝血 ，分离外周血单个核细胞，计数并 隆抗体OKT3以来 ，陆续有多种动物的CD3单克隆 调整至 2×10。个 ／mL，取 5mL细胞液加人细胞瓶 抗体被成功制备 。CD3分子 的单克隆抗体在 T细 内培养 ，ConA(10~／g／mL)刺激 24h，离心沉淀细 胞亚群检测等方面具有重要 的应用价值 。猪 CD3 胞 ，用 RNAVizol提取总 RNA，Oligod(T)反转录 单克隆抗体制备在 国内还未见报道。CD3由7、、 为 cDNA后 ，F1、R1为 引物进行第一步扩增 ，随后 e、、 五条多肽链组成 ]，其 中多数单克 隆抗体均 以第一步扩增产物为模板 ，F2、R2为引物进行第二 是针对 ￡链 [3]。本研究成功构建 了表达猪 CD3￡基 步扩增，两步 的扩增 条件均为：94℃预变性 10min， 因的重组腺病毒 ，并对其免疫原性进行了测定 ，以期 94℃ 1min，56℃ 1min，72℃ 1min，33个循 环 后 ， 为猪 CD3e单克隆抗 体的制备奠定基础 ，并为其他 72℃延伸 10min。产 物 在 1 琼 脂糖 凝 胶上 电泳 观察。 细胞表面分子单克隆抗体的制备提供借鉴 。 1．3 CD3~重组腺病毒 的构建 回收 PCR产物并 1 材料与方法 与 pDC316载体经限制性 内切酶 HindⅢ、Sal工酶 1．1 材料 大肠杆菌 DH5d、293细胞 、BHK 21细 切后连接 ，构建 pDC316一CD3~质粒 ，阳性菌落经 胞由本实验室保存 ；猪 CD3~重组蛋 白由本实验 室 PCR和测序鉴定 。将 pDC316一CD3~质粒和腺病毒 制备并保存 ；SPRD 标记 CD3~单克 隆抗体购 自 辅助质粒 pBHGloxAE1，3Cre共转染 293细胞 ，观 Southern Biotech Association 公 司；穿 梭 质 粒 察细胞病变 。 pDC316和辅助质粒 pBHGloxAE1，3Cre购 自加拿 1．4 CD3~重组腺病毒 的鉴定 采用 PCR法和直 大 MicrobixBiosystems公 司；HRP标 记山羊抗小