分子生物学诊断技术的应用（四）.pdfVIP

4 湖 北 畜 牧 兽 医 2010正 分子生物学诊断技术的应用(四) 杨 峻 f湖北省农科 院畜牧兽医研究所／动物胚胎T程及分子育种湖北省重点实验室 ．武汉 430064) 中图分类号 ：$854．4+3 文献标识码 ：B 文章编号 ：1007—273X 2《010)12—0004—03 直接利用 RNA进行序列测定 ：在杂交质粒的多 7 核酸序列分析技术 克隆位点两侧插入一段能被噬菌体 RNA聚合酶识 核酸是生命的遗传物质 ．遗传信息存在于 4种 别的启动子 ．在噬菌体 RNA聚合酶的作用下 ．在体 单核苷酸 (A，G，C，T)按不同顺序连接而成的核酸分 外将克隆的外源双链 DNA转录为单链 的RNA．以 子中．迅速准确地解读决定生命性状的密码 ．测定基 RNA为模板 ，与引物退火后 。在反转录酶 (如AMV) 因组的核酸序列 ．对于识别病原 ，揭示疫病变化规律 作用下 ．按双脱氧链终止法步骤进行序列分析。 是其他任何方法都无法 比拟的．但它也是最烦琐和 PCR技术的采用 ：PCR技术的出现 ，使序列分析 最复杂的检测技术 ．目前在动物检疫中尚较少采用 ， 用DNA模板的制备更加方便 。①例如用PCR法合 但有时是必须且正 日益变得常用 。 成双链 DNA片段，直接用双链进行测序。②在 PCR 7．1 技术原理 扩增时．两个引物之一 的5端生物素化 ．扩增后将 目前 应 用 最 多 的快 速 测 序 技 术 是 Saner DNA变性 。通过亲和素柱 ．分离 5端含生物素 的单 等 (1997)提出的双脱氧链终止法。其原理是 ：核酸 链 。③利用不对称PCR，按 1：50匹配两引物含量，产 模板在核酸聚合酶 、引物、四种单脱氧碱基存在条件 生单链DNA。(~)GAMTS法．在两个PCR引物之一的 下复制或转录时．如果在四管反应系统 中分别按比 5端连接噬菌体 RNA聚合酶启动子序列 ．这样经 例引入 四种双脱氧碱基 。只要双脱氧碱基掺人链端 ， PCR扩增产生 的双链 DNA片段 的一端就带上 了该 该链就停止延长 ．链端掺入单脱氧碱基的片段可继 启动子序列。然后 以扩增出的双链 DNA为模板 ．在 续延长 如此每管反应体系中便合成以共同物为 5 噬菌体 RNA聚合酶作用下转录出单链 RNA 再以 端 ．以双脱氧碱基为 3端的一系列不等的核酸片段。 单链 RNA为模板进行序列分析 反应终止后 ．分 四个泳道进行电泳以分离长短不一 7．2．2 采用高分辨率的凝胶 电泳技术 的核酸片段 (长度相邻者仅差一个碱基)，根据片段 采用薄胶 ：凝胶厚度减少到0．5ram或0．1mm．样 3端的双脱氧碱基 ．便可依次阅读合成 的碱基排列 品泳动加快 ，自显影时减少 B粒子在凝胶 中的散射 ， 顺序。 提高分辨率 7-2 研 究进展 采用梯度胶 ：包括离子梯度和浓度梯度 ．使 7．2．1 几种快速获取模板 的方法 DNA片段泳动均匀．大小不同而又很相近的大片段 单链噬菌体系统 ：利用克隆载体 M13噬菌体浸 更易拉开距离 染大肠杆菌 ．在细菌细胞噬菌体基因组以复制型双 采用鲨鱼齿梳 ：使相邻泳道相互靠近 ．不但在显 链 DNA存在 ．并经滚环式复制产生子代 噬菌体正链 影图上更易判定相邻带 的上下关系．而且可以增加 DNA，