犬细小病毒和犬冠状病毒双重PCR方法的建立及应用.pdfVIP

动物医学进展 ，2011，32(10)：71—74 ProgressinVeterinaryM edicine 犬细小病毒和犬冠状病毒双重 PCR方法的建立及应用 林 颖 ，耿庆华 ，付海滨 ，李俊环 ，闫明媚 ，李成镛 ，林书铭 (1．沈阳出人境检验检疫局，辽宁沈阳 l10016；2．辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳 l10161) 摘 要：根据 GenBank中犬细小病毒 (CPV)和犬冠状病毒 (ccV)基 因序列各设计 了一对引物，经试验 条件 的优化，建立 了检测CPV的PCR方法和 CCV 的 RT—PCR方法，扩增 目的片段大小分别为 337bp和 852bp。在此基础上建立 了检测 CPV 和 CCV 双重 PCR方法。该双重 PCR方法能特异的扩增 CPV 和 CCV，且分别扩增 出1．08ng和3．2ng总核酸量。通过检测96份临床样品，对双重PCR方法和胶体金试纸 条方法进行了对比试验 。结果表 明，建立的双重PCR方法快速 、敏感、特异性高，可以用于 CPV和 CCV鉴 别检 测 。 关键词：犬细小病毒 ；犬冠状病毒 ；双重PCR 中国分类号 ：$852．659．2；$852．659．6 文献标识码 ：A 文章编号 ：1007—5038(2011)10—0071—04 犬细小病毒感染 (Canineparvovirusinfection) 称吉林疫苗)。犬冠状病毒，犬肾传代细胞 (MDCK) 又称犬传染性出血性肠炎 ，是由犬细小病毒 (Canine 由沈阳农业大学馈赠 。病料为来源于 12家动物医 parvovirus，CPV)引起的犬急性传染病。CPV基因 院临床病犬粪便样品，共 96份。 组为单股负链 DNA／¨，临床上多 以出血性肠炎发 1．1．2 试剂 DNA聚合酶、dNTP、R，r_PCR反应 生 ，如不及时治疗大多以死亡为终结 2【]。犬冠状病 试剂盒 、DNAMarker100bpLadder、胶 回收试剂盒 毒性腹泻 (Caninecoronavirusdiarrhea)是由犬冠状 等均为宝生物工程 (大连)有限公司产品；Ambian磁 病毒 (Caninecoronavirus，CCV)引起 的犬急性肠道 珠试剂盒为北京吉泰生物技术有限公司产品。 性传染病，病毒核酸为单股 RNA。CPV与CCV引 1．2 方法 发疾病的临床表现极为相似，且常发生混合感染，给 1．2．1 引物合成 从 GenBank中分别获得 5株 鉴别诊断带来 困难[s-53。多重 PCR技术是在 同一 CPV和 2株 CCV 的全基 因序列，利用生物软件 PCR体系中加入多对引物 ，对多个 目的基 因同时进 CLUSTALX进行序列 比较分析 。用 Oligo6设计 行扩增的分子生物学诊断方法，可 同时检测多种病 CPV和CCV特异性引物 ，扩增 CPV引物P1和P2， 原体或多个基因型，达到对多种疾病的同步诊断，缩 可扩增片段为 337bp；扩增 CCV引物 C1和 C2，可 短检测时间[6-8]。本试验在单项 PCR检测方法基础 扩增 852bp。序列 为 P1：5 一AAG ACG TGC 上，建立了双重 PCR方法 ，即一次可 同时快速鉴别 诊断CPV和 CCV两种病毒感染，为这两种疾病提 AAG CGA GTC C 一3 ；P2：5 一GAG CGA AGA 供快速诊断方法 。 TAA GCA GCG TAA 一3 。C1：5 一AGA TGT TGC GTG TAT TGG T 一3