弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定与PCR-SSCP分析.pdfVIP

微生物学杂志年 月第 卷第 期 . . 弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定与. 分析 胡秀彩,王 艺,吕爱军 徐州师范大学 生命科学学院,江苏徐州 摘 要 利用营养琼脂、 培养基从草鱼肠道中分离到 株细菌,暂时编号为 ? 、和 一 ,通过形态 学观察、生理生化特征、药敏试验、动物试验、构建系统发育进化树及 ? 分析等系统鉴定,结果表明 株菌株均为弗氏柠檬酸杆茵 ,其中茵株对小鼠、斑马鱼有致病性; 株杆菌均对头孢 噻肟、头孢曲松、洛美沙星、诺氟沙星等多种药物敏感;系统发育分析表明, 株弗氏柠檬酸杆菌 序列 与 模式株同源性分别为 . %、 . %和 . %,且位于系统发育树的同一分支;进一步采用区? 分析结果显示弗氏柠檬酸杆菌 图谱中茵株间带型存在差异。 关键词 弗氏柠檬酸杆菌;鉴定;;? 中图分类号 文献标识码文章编号 ??? ? , ,? .
.,., ,一 , 一一 ,,? , , , , . . ,. ,, , , . . % , . % . % , .. ;; ;? 草鱼 是中国主要 等多种人畜共患病原菌 。最近 食用经济鱼类之一。近年来草鱼养殖规模和产量 等 从沿海鱼类的肠道、鳃等组织中分离到大肠 快速发展,同时细菌性病原感染给草鱼养殖业带 埃希菌、弗 氏柠檬酸杆菌 来了巨大的经济损失?。随着河流、海洋环境的 、普通变形杆菌 . 污染,人畜共患病原菌开始感染鱼类,已报道从鱼 等人类致病菌,证实对氨苄青霉素耐药率达 类等水生动物中分离到气单胞菌、柠. %。弗氏柠檬酸杆菌是 一 檬酸杆菌 、假单胞菌 种“人.兽.鱼”共患病病原菌,可引起人、哺乳动 基金项目:国家自然科学基金资助项目 ;江苏省高校“青蓝工程”项目 作者简介:胡秀彩 女,硕士。研究方向为微生物资源学。 . :. 通讯作者。 : ,: .收稿日期: ;修回日期:? 期 胡秀彩等:弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定与 分析 物、鱼、鳖、虾等感染发病 “ 。目前关于鱼类肠 . . 细菌总提取、基因的 扩增及系统发育树分析 采用革兰阴性菌基因组 道中弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定研究,国内外鲜 有报道 。本研究以草鱼为实验对象,从其肠道 提取试剂盒提取细菌总,经琼脂糖凝胶电泳 检测后,将 株菌的总于一 ℃保存备用。 中分离到 株弗氏柠檬酸杆菌,并进行形态学观 察、生理生化特征、药敏试验、动物试验、构建系统 以总为模板,采用细菌通用引物进行 基因扩增,正向引物: ? 发育进化树及一单链构象多态性分析 , ,,反向引物:? 为鱼类疾病诊断防治提供一定的理论参考。 反应体系分别包括: / 的 聚合酶 . , × , 材料与方法/ 的 . , ./ 的混合物 .,引物各 . ,模板 .. 材料 ,无菌双蒸水 .。反应条件: ℃预 . . 实验动物 草鱼购自徐州市某菜市场,随 变性 、 ℃变性、 ℃复性 、 机选取体重约 左右的草鱼用于细菌分离; 延伸, 个循环后 ℃延伸。 斑马鱼 平均体重约 . 购自徐州市某花鸟 产物连接 . 载体,转化大肠埃希菌 市场;小鼠 平均体重 购自徐州医学院实验 筛选阳性克隆,送上海生工生物工程有限公司测 动物中心。 序。将 株菌的 基因序列通过 . . 培养基 麦康凯琼脂 、伊红美蓝琼 的 检 索 系 统 ://. 脂 、三糖铁琼脂 培养基、常规细菌微/ / 进行序列同源性分析, 量生化鉴定管、肠杆菌科细菌生化编码鉴定管 使用 . 软件与从 数据库中获 、药敏纸片等购自杭州微生物试剂有限 公司。 得的细菌 基因序列进行多序列匹配排 列,采用邻接法 .. 主要试剂 革兰阴性菌基因组提取试剂 构建系统发育树,并通过 次 盒、引物、聚合酶、 等购自上 的自举分析 进行置信度检测。 海捷瑞生物工程公司, . 试剂盒购 . .基因 区的 分析 自公司。 . 方法 以总 为模板,正向引物: .,反 向引物. . . 菌株分离、形态观察与生化试验 无菌操 作取草鱼中后部肠道,用无菌生理盐水冲洗 次,。 汕 反应体系包括: / 的 聚合酶 . , × , 刮取鱼肠内容物,加无菌生理盐水于离心管中混/ 的 . , . / 的 混 匀后/ 离心,吸取适量上清液涂布 普通营养琼脂、平板, ℃培养,挑取菌 合物 .,引物各 . ,模板 ., 落形态特征不同的单个菌落进行分离纯化,获得 无菌双蒸水 . . 。反应条件: ℃预变性 、 变性 、复性、 ℃延伸 纯种转接试管斜面培养基上保存、备用。获得菌, 个循环后 ℃延伸。扩增产 株经革兰染色,在光学显微镜下观察;同时挑取单 菌落,用 %的戊二醛固定 ,洗 次,