高纯度牦牛子宫内膜基质细胞的分离培养及其鉴定.pdfVIP

中回磨擘亟报 , : ? 高纯度牦牛子宫内膜基质细胞的分离培养及其鉴定 吴庆侠,董海龙,芮亚培 西藏农牧学院动物科学学院,西藏林芝 摘要:为获得高纯度的牦牛子宫内膜基质细胞,对牦牛子宫内膜使用胶原酶消化,分离基质细胞进行体 外培养,研究其生长特性,并对其进行免疫细胞化学染色鉴定。结果,牦牛子宫内膜在 ℃条件下,以/ 的胶原酶Ⅱ消化 . ,更换新鲜消化液继续消化 . ,消化效果好;用 滤网过滤,再经 / 离心和自然沉降去除上皮细胞,可分离得到大量的单个细胞,所得细胞贴壁后可见梭形和多 角形 种形态,免疫细胞化学染色显示这 种形态的细胞均表达波形蛋白,阳性率可达%以上,不表达 角蛋白。结果证明已成功分离到高纯度的牦牛子宫内膜基质细胞。 关键词:牦牛;子宫内膜;基质细胞;免疫细胞化学 中图分类号: . 文献标志码: 论文编号:, , ,,,: , , , . / Ⅱ ., /. ;, /, . . , % , . .:;; ; 引言 可为牦牛子宫内膜基质细胞系的建立以及牦牛子宫生 子宫是孕育胎儿的器官,子宫内膜是胎儿与母体 理及胚胎附植机理的研究奠定基础。 的接触部位,也是卵巢激素作用的靶组织。体外培养 材料和方法 的子宫内膜细胞被越来越广泛地应用于研究胚胎与子 . 材料 宫的相互作用,卵巢激素的作用机理 ,子宫局部免 .. 子宫来源 从八一镇屠宰场采集牦牛子宫。 疫机理等方面 。要进行上述研究,必需要获得高纯 . . 生化试剂 ./、胶原酶 活性 : 度、生长良好的子宫内膜细胞。国内外关于子宫内膜 均为 产品;胎牛血清购自杭州四季青生物制品 细胞分离培养的研究很多,但还未见关于牦牛这一方 公司;胰蛋白酶为上海生工产品,活性 :;青霉素和 面的报道。探讨牦牛子宫内膜细胞的分离培养方法, 链霉素为哈药集团制药总厂生产;鼠抗人角蛋白 单 基金项目:教育部科学技术研究重点项目“永生化牦牛子宫内膜细胞系的建立”;“工程”三期高层次人才科研启动费项目“牦牛子宫内 膜细胞在局部免疫调节中的作用” 一 。 第一作者简介:吴庆侠,女,年出生,陕西城固人,讲师,博士,主要从事家畜生殖内分泌与生殖免疫研究。通讯地址:西藏自治区林芝八 一 镇西藏农牧学院动物科学院, : , .。 收稿日期:. . ,修回日期:? ? 。中国农孝通报://. . . 克隆抗体 一抗 、鼠抗人波形蛋白多克隆抗体 一抗 ; 液,然后按 : 传代。 浓缩显色液、 . 试剂盒为武汉博士德公司产品。 . . 牦牛子宫内膜基质细胞的鉴定 待传至 代的细 . 主要仪器和设备 细胞培养瓶、 孔细胞培养 胞在 孔培养板上铺满皿底后,吸弃培养液,用甲 板、 孔细胞培养板 公司 、离心机 公司、 衡盐溶液洗涤 次, %酒精固定 ,洗涤 超净工作台 苏净集团安泰公司 、组织培养倒置显微,浸入 . % :一, ℃, ,以阻断内源 镜 公司、 培养箱上海福玛试验设备有限公 性过氧化物酶。振洗× 次。滴加山羊血 司 。 清,在湿盒内, ℃, ,以消除非特异性染色。甩 . 方法 去血清,分别滴加鼠抗人角蛋白 单克隆抗体 : . . 子宫取样 牦牛经颈静脉放血处死后,迅速采取 稀释 和鼠抗人波形蛋白多克隆抗体 : 稀释 ,同 子宫,根据以往的研究及个人经验,通过眼观和触诊卵 时以等量的液做空白对照,湿盒内 过夜。 巢以及子宫的方法来判断子宫是否正常。选择临床正 振洗 次。滴加生物素化羊抗小鼠 ,室温 常的子宫,将其浸入含有 / 青霉素、/ 。振洗 次。滴加链霉菌抗生物 链霉素的液中,带回实验室。 素一过氧化酶溶液,室温 。振洗 × 次。滴加工作浓度的显色液,暗处作用 , . . 牦牛子宫内膜的消化 在超净工作台内,取出子 宫,剪取一 段子宫角,剔除脂肪,置含有双抗的平 自米水冲洗,苏木素复染,显微镜观察。 衡盐溶液中反复冲洗以去除血污,纵向剖开子宫角,剪 结果与分析 取子宫内膜层,用平衡盐溶液冲洗次以洗去 . 牦牛子宫内膜的消化效果 应用 / 的胶原酶 消化 . ,更换新的胶原 粘膜上的黏液,直至液体清亮。将其投入血清瓶,剪成 肉糜状,平衡盐溶液冲洗次,移入三角瓶中, 酶 继续消化 . ,消化结束后,发现细胞悬液粘度 小,易过滤,显微镜下观察悬液中含有大量的葡萄串状 按标本体积的倍加入 / 的胶原酶 ,水浴 消化 . ,期间振摇次,吸出悬液, / 离心 团块和单个散在细胞,台盼蓝拒染法检测细胞活率人 于 %。 ,弃去上清液,再次按沉淀体积的 ~ 倍加入 / 的胶原酶 , ℃消化 . 。牦牛子宫内膜基质细胞的分离效果 . . 牦牛子宫内膜基质细胞的分离与培养 消化完 消化所得细胞悬液经 滤网过滤,