口蹄疫病毒抗原胶体金试纸条研究.pdfVIP

动物医学进展, , : ? 口蹄疫病毒抗原胶体金试纸条的研究 吕建强 ,杨俊兴 ,花群义 ,曹琛福 。,张彩虹 , 陶 虹 。,刘建利 ,阮周曦.深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心,广东深圳 ; .深圳市外来有害生物检测技术研发重点实验室,广东深圳 摘 要:利用单克隆抗体技术制备抗口蹄疫病毒的单克隆抗体,特异性试验表明其只与 、 、型 种血清型 抗原结合。进而采用胶体金标记技术,以胶体金标记的抗口蹄疫病毒单克隆抗体、多克 隆血清抗体和葡萄球菌 蛋白为主要材料,研制口蹄疫快速检测试纸条。该试纸条检测 、 、型 种血清型灭活口蹄疫病毒均为阳性,检测水疱性口炎病毒、猪水疱病病毒、蓝舌病病毒、猪蓝耳病病毒 种灭 活抗原及小反刍兽疫病毒疫苗株均为阴性,试验结果与口蹄疫实时荧光定量 ?方法的完全一致,表 明其具有良好的特异性。敏感性试验结果是,试纸条的检测极限为 : 稀释的样品,其敏感性相当于实 时荧光定量 ?方法的 / 。由于试纸条具有操作方便、检测快速等优点,因此该试纸条可以用于大 量临床样品的快速检测和现场检测。 关键词:口蹄疫病毒;单克隆抗体;胶体金试纸条 中图分类号: .. 文献标识码: 文章编号: ?? ? 口蹄疫, 是由口 灭活抗原及相应豚鼠血清抗体均购白兰州兽医研究 蹄疫病毒 ,所;水疱 性 口炎病毒、猪水疱病 病毒 引起的一种急性、热性、高度接触传染性和快速远距、蓝舌病病毒、猪蓝耳病病毒 离传播的动物疫病,被世界动物卫生组织 列 种灭活抗原及小反刍兽疫病毒为必须报告的传染病。国内外在口蹄疫血清学检测 疫苗株由深圳出入境检验检疫局动检实验室保存。 方法方面做了广泛深入的研究,但是在抗原检测方 . . 主要试剂 盒及耗材 氯金酸、为 ? 法的研究方面略显不足。快速、方便、灵敏、简单的公司产品;背衬、硝酸纤维素膜、吸水垫、样品垫 病原诊断方法对口蹄疫疫情监测和预警起着至关重 和金标垫均为 公司产品;单抗亚型鉴定试 要的作用,而传统的诊断方法如乳鼠中和试验、补体 剂盒为结合试验等都有成本高、耗时及需要生物安全防护 公司产品;蛋白 / 单克隆抗体纯化 等缺点,且不利于基层工作者应用,因此研制快速、 试剂盒为 公司产品。 直观、准确的检测方法是口蹄疫疫情防控的关键。 . . 实验动物 周龄~ 周龄 / 小鼠购 胶体金标记的免疫层析技术,具有简单、快速、直观 自中山大学动物医学实验中心。 和不需要特殊仪器以及无需增殖病原的特点,适用 . 方法 于基层兽医站、养殖场和疫病的大面积普查及口岸 . . 口蹄疫单克隆抗体的制备及纯化 现场检测等方面 。本文研制了一种特异、简便、 . . . 动物免疫 用 型 灭活抗原免疫 快速、直观的胶体金快速检测试纸条,其可以/ 小鼠 只,每隔 周免疫 次,共免疫 次, 分别检测 、 、 型口蹄疫病毒抗原,为有效 注射剂量分别为、 、 /只。首免时抗原 监控口蹄疫疫情提供了有力的工具。 中加等体积弗氏完全佐剂乳化,二免和三免时加等 材料与方法 体积弗氏不完全佐剂乳化。 。三免后,断尾采 . 材料 血分离血清,用间接 检测血清抗体效价,用 . . 病毒抗原及血清 、 、 型小鼠血清作为阴性对照血清。选取 血 收稿日期: 基金项目:中华人民共和国质量监督检验检疫总局科研项目 。作者简介:吕建强 一 ,男,内蒙古临河人,高级兽医师,博士,主要从事动物病毒学及疫病检测方法研究。 通讯作者吕建强等:口蹄疫病毒抗原胶体金试纸条的研究 . . 胶体金标记单克隆抗体的制备 采用柠檬 清抗体效价高的小鼠,通过尾静脉注射 灭活 抗原强化免疫 次,剂量为 /只, 后即可用 酸三钠还原法制备胶体金溶液。向 三蒸水 中加入浓度为 / 的氯金酸溶液,加热至 于分离脾细胞,进行与/ 细胞的融合。 . . . 分泌抗 单克隆抗体杂交瘤细胞株 沸腾,迅速加入 .. / 柠檬酸三钠溶液, 充分混匀,继续加热约 ,溶液由蓝色 的建立 将免疫鼠脾细胞和/ 骨髓瘤细胞进行 融合,加入适量的含 的选择性培养基进行培 变为红色即可。向 胶体金溶液中加入适量 养,分别用 、 、 型 种血清型灭活 纯化后的抗 单克隆抗体,室温搅拌 , 缓慢加人 / 继续搅拌 。 及细胞建立的间接 进行筛选。对 、 、 型 种血清型灭活 建立 检 / 离心 ,转移上清至另一离心管 测为阳性且细胞 检测为阴性的杂交瘤 中, / 离心 ,小心弃去上清,用 细胞进行 次~ 次亚克隆,选择并确定可以稳定 / . 重悬沉淀。将 × 的玻璃纤维棉浸泡于金标 溶液中,取出 分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株。 . . . 单克隆抗体亚类鉴定 取培养上清,按照 真空抽干后 。 避光保存。 . . 检测线和对