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环 境 科 技. .
第 卷 第 期.年 月
降解菌? 甲氰菊酯水解酶的提取及酶学特性研究
张敏健, 徐 明, 徐婧静
江苏省环境科学研究院, 江苏 南京
摘 要: .? 是一株甲氰菊酯降解茵。提取该茵株的甲氰菊酯水解酶,时其酶学特性进行了初
步研究。该酶水解甲氰菊酯的最适 值为 . ,最适温度为 ℃,供试的金属离子均对酶活性有一定的抑制作用,抑
制率与金属离子的浓度呈正相关,其中 的抑制作用最强烈,几乎可以导致酶活性完全丧失。该酶在极性有机溶剂
中比在非极性的有机溶剂中稳定。
关键词: 降解茵 ? ; 甲氰菊酯水解酶; 提取; 特性
中图分类号:文献标识码: 文章编号: ? ?一 ,,:. .,. . . ,.. ? .: ? ; ;;
拟除虫菊酯农药 简称“菊酯类农药” 是一类广 为研究材料【,提取了该菌株的甲氰菊酯水解酶,对
谱性杀虫剂.具有强烈的触杀活性,广泛应用于农作 其酶学特性进行了研究,为其在环境治理中的应用
物灭虫、家庭卫生和园艺花卉,从而随着农田排水、 提供理论依据。
降雨淋洗进入水环境,造成环境的农药污染。菊酯类
材料与方法
农药品种较多、化学结构复杂。目前利用微生物产生的
降解酶治理农药污染是一种非常有效的方法,微
. 菌种
生物降解农药的本质是利用细胞产生的酶来发挥作
从甲氰菊酯生产企业的排水口附近的污泥中分
用。大量的研究结果表明,酶比产生该酶的微生物菌
离到一株高效降解细菌? ,经培养、纯化,形态
株的降解效率更高。而且它可以直接用于消除作物
学、生理生化特性与 基因同源性比较,将
和蔬菜叶面的农药残留 。
其鉴定为鞘氨醇单胞菌属 。
甲氰菊酯 仅一氰基一 一苯氧苄基一 , , , ,一四
. 培养基与试剂
甲基环丙烷羧酸酯 为拟除虫类杀虫剂,在常温下比培养基 值 . :蛋白胨质量浓度 .较稳定,微溶于水,在日光、热和水下稳定;对害虫
,酵母膏质量浓度 ./ , 质量浓度 .具有触杀和趋避作用,主要用于防治棉花、蔬菜、果
/ 。磷酸盐缓冲液缓冲液值 . :溶液
树、茶叶等作物上的咀嚼式口器和刺吸式口器的各质量浓度 ./ ,溶液
种害虫,尤其对螨类杀虫效果最为突出 。本研究以 质量浓度 ., 。将 溶
甲氰菊酯高效降解细菌? .
液 和 溶液 混合,加水至 ,得到
收稿日期: ?./ 的。甘氨酸一 缓冲液值
作者简介:张敏健 一 ,女,江苏海门人,本科,工程师,从事环境. :将质量浓度 .的甘氨酸溶液科研管理工作. 环 境 科 技 年 月
和浓度 ./ 溶液 混合.加水至 。
. 细菌生长量的测定
细菌的生长量用分光光度法测定。细菌培养后
用无菌水洗涤菌液,最后加入与菌液等体积的无菌
水后测定,细菌的生长量以波长 处的光
密度表示。
. 粗酶液的制备
/将菌液离心 /,得到沉淀的
图 培养时间对菌株生长和产酶的影响
菌体。用缓冲液洗涤菌体 遍,再用超声波粉
碎 冰浴中,且间隔操作 ,将细胞破碎液离心 /,取上清液并加入研细的固体硫
酸铵粉末搅拌 ~,分段进行盐析,收集蛋白
沉淀 %一 % ,将蛋白沉淀溶于少量的缓
冲液中,在缓冲液中透析 ,透析得的
酶液进行冷冻真空干燥后,用缓冲液溶解,即
得粗酶液。
盟厦/
. 蛋白质含量的测定
图 温度对酶活的影响
.值对酶活的影响
粗酶液蛋白质含量按 法测定。以牛血
清白蛋白 作为标准蛋白。 分别在 值 . , . , . . 条件下测定
. 酶活力测定方法
酶活力,结果见图 。此酶在 值 . ? . 都能有
取质量浓度/ 甲氰菊酯 甲醇作为溶剂 较高的酶活,酶作用的最适 值为 . 。说明此酶 ,缓冲液 ,加人 粗酶液进行 对 值的耐受范围较广,但是,在中性的环境中更
有利于此酶作用。
降解℃ ,后,加人浓度/
终止反应。再加入 正己烷剧烈振荡 ,
进行萃取,将混合液离心/,取上
层有机相于气相色谱检测。通过甲氰菊酯的标准曲
线。求得甲氰菊酯的减少量。本实验的 个酶活力单
位 定义为在本实验条件下 内甲氰菊酯减少
的微摩尔数。
结果与讨论值
图 值对酶活的影响
. 茵株生长与产酶的关系
. 有机溶剂对酶活性的影响
取菌株接种于 培养基中,/ 摇床分
在含有 / 不同有机溶剂 甲醇、乙醇、
别培养 , , ,测定菌株的生长量
乙醚、氯仿、二甲苯、正己烷 的缓冲液中加入
和总酶活,结果见图 。由图 可见:①菌株培养时
酶液与底物进行反应,然后测定酶活力,以未加有机
问和产酶有相关性: ~ 为产酶的较适培养时
溶剂的酶活力为%,结果见图 。
间;②菌株的生长量与总酶活具有一定的相关性,开
始时菌株生长较慢,总酶活很低,随着菌株进入对数
期,总酶活显著增加,达到最大,超过,
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