原核表达载体pET28a-EGFP的构建与表达.pdfVIP

微 生物学杂志 2011年7月第31卷第4期 JOURNALOFMICROBIOLOGYJuly2011Vo1．31No．4 69 原核表达载体 pET28a-EGFP的构建与表达 季爱加 ，宁喜斌 ‘ (上海海洋大学 食品学 院，上海 201306) 摘 要 以质粒 PEGFP—N3中增强型绿色荧光蛋 白(EnhancedGreenFluorescentProtein，EGFP)基 因片段为模 板 ，利用PCR技术扩增得到EGFP基 因片段 ，并设计引物在其 2端引入酶切位 点EcoRI和饿 Ⅲ，对 引入酶 切位点的 EGFP片段和 pET28a质粒进行双酶切处理后 ，利用 T 连接酶连接得到 了重组质拉 pET28a．EGFP。 利用热击法把得到的重组质粒 pET28a—EGFP转化至E．coliBL21(EscherichiacoliBL21)感受态细胞 中，当大肠 埃希茵LB(Luria·Bertani)培养液在600nm下的光密度值 DD600=0．4时，通过添加异丙基硫代 B—D一半乳糖苷 (IPTG)作为诱导剂诱导EGFP表达。结果表明：重组质粒酶切鉴定及测序结果正确。在 自然光下，转化子在 LB固体培养基(舍 lmmol／L的 IPTG和5O g／mL的卡那霉素(Kan))中茵落呈绿色。在荧光显微镜下受蓝 光激发，可 以清楚观察到发绿色荧光的转化子。成功构建的原核表达栽体 pET28a．EGFP在 E．coliBL21中得 到了高效表达 ，为以后作为荧光标记物标记食源性病原茵提供 了一定的理论和技术支持 。 关键词 绿色荧光蛋 白；构建；大肠埃希茵；表达 中圄分类号 Q782 文献标识码 A 文章编号 1005—7021(2011)04—0069—05 ConstructionandExpressionofProkaryoticExpressionVectorpET28a-EGFP JIAi-jia．NINGXi—bin (CoILofFoodSci．＆Techno1．，ShanghaiOceanUni．，Shanghai201306) Abstract Anenhancedgreenfluorescentprotein(EGFP)genefragmentinplasmidPEGFPN·38satemplatewas usedtoamplifyandobtainedtheEGFPgenefragmentbyPCR，andthendesignedaprimertointroduceEcoR Iand HindIIIsitestoitsbothends．Aftertreatedwithdoublerestrictionenzyme，theintroducedenzymaticsiteEGFPgene fragment，andpET28aplasmid，arecombinantexpressionplasmidpET28a·EGFP wasobtainedusingT4ligase．The pET28a-EGFPwastransformedintocompetencecellsofE．coliBL21withheatshockmethod．Theinducerofisopro- pylp—D一1一thiogalaetopyranoside(IPTG)wasaddedtoinduceEGFPexpression，astheopticaldensityunder600nm DD600=0．4oftheE．coliLB (Luria—Bertani)culturemedium．Theresultsindicatedthattherecombinantplasmid enzymaticsitescharacterization and sequencingwascorrect．Underthenaturallight，thetransformantcol