猪ATF4基因真核超表达载体的构建及鉴定.pdfVIP

巾圈摩 学通攉 2011,27(23)：6-11 ChineseA~riculturalScienceBulletin 猪ATF4基因真核超表达载体的构建及鉴定 陈 超 ，吴望军，熊远著 (华中农业大学农业部猪遗传育种重点开放实验室，武汉 430070) 摘 要 ：克隆猪 乃 基因CDS，构建pcDNA3．1(+)．抒 真核超表达载体，为下一步在细胞水平和个体 水平研究该基因功能奠定基础 。提取RNA，运用RT-PCR和巢式PCR技术扩增猪ATF4全部编码序列， 克隆转化到pMD18一T载体中，测序验证后，酶切连接到pcDNA3．1(+)载体中，构建成pcDNA3．1(+)一 真核超表达载体 ，对其进行酶切和测序鉴定并在细胞水平上进行表达量的鉴定。实验结果表明，在转染 了pcDNA3．1f+)一刀 载体的细胞中，ATF4mRNA表达水平明显增加，成功构建了pcDNA3．1(+)．力 真核超表达载体，为进一步研究该基因的功能奠定了基础。 关键词：猪 ；ATF4；载体构建；瞬时转染 中图分类号：$813．1 文献标志码 ：A 论文编号：2011—0211 ConstructionandIdentificationofpcDNA3．1(+)一ATF4ofPig ChenChao，WuWangjun，XiongYuanzhu (MyLaboratoryofSwineGeneticsandBreeding, n ofAgriculture，HuazhongAgriculturalUniversity，Wuhan430070) Abstract：WeconstructaneukaiyoticexpressionvectorpcDNA3．1(+)一ATF4bycloningporcineATF4gene， whichprovideUSadvantageforfurtherstudyofgenefunctionatthecellularand individualleve1．Extracted RNA andusingRT-PCR andnestedPCRmethod，weamplifiedcodingsequenceofporcineATF4andcloned itintothepMD18-TvectorandthenconsturctedpcDNA3．1(+)一ATF4vectorwhichwasidentifiedby restriction enzyme analysisand DNA sequencing．The results show thatwe successfully constructan eukaryoticexpressionvectorpcDNA3．1(+)-ATF4．Transientlytransfectedcellsandeffectofexpressionis obvious，whichwillcontributetofurtherstudyontheATF4functionandtotheestablishmentofcondition． Keywords：pig；ATF4；consturctedvector；transienttransfection 0引言 发现在缺氧的情况下，其表达量上升，可能与肿瘤细胞 ATF4 (activating transcription factor4)亦 称 适应缺氧环境有关 ]。最近研究发现ATF4被作为一 CREB2、C／ATF，属于碱性亮氨酸拉链蛋 白家族”。人 种新的软骨细胞Ihh信号的转录调节因子，通过控制 的ATF4cDNA全长序列早在 1991年就利用人T淋 巴 生长板软骨细胞增殖和分化来引导纵骨 的生长 。 细胞I型病毒LTR的TAX相关序列的启动子作为探针 ATF4被证 明在许多生理过程中发挥作用6[-7]，如在调节 序列(TGACGTCT)从人类Lgtl1文库 中