黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因（bgl1）的克隆及其在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中的表达.pdfVIP

Onlinesystem：http：Hwww．jabiotech．org 农 业 生 物 技 术 学 报 JournalofAgriculturalBiotechnol0gy 2012，20(12)：1449～1456 DOI：1O．3969／j．issn．1674-7968．2012．12．012 研究报告 Le~er 黑曲霉 I3一葡萄糖苷酶基因(6 )的克隆及其在中国仓 鼠卵巢 (CHO) 细胞中的表达 黄妙容 阳建辉 刘德武 黄晓灵 蔡更元 吴珍芳 1华南农业大学动物科学学院，广州 510642；2岳阳职业技术学院，岳阳414000；3广东省农业科学院畜牧研究所，广州 510642；4肇庆大华 农生物药品有限公司，广东省兽用生物制品技术研究与应用企业重点实验室，肇庆 526238 通讯作者，wzfemail@163．com 摘 要 B一葡萄糖苷酶是纤维素酶系三大成员之一，被认为是纤维素糖化的限速酶。本研究克隆黑曲霉 p．葡萄糖苷酶基N(bgl1)，并在中国仓 鼠卵巢(CHO)细胞中进行表达分析。以GenBank上黑曲霉p一葡萄 糖苷酶基因(6 )序列为模板，设计特异性引物，从黑曲霉 sperjillusniger)基因组DNA中扩增 目的片 段，通过SOE．PCR的方法将猪腮腺分泌蛋 白信号肽序列 sp和6J相连，成功构建分泌型真核表达载体 pc6一sp一6 ，利用脂质体介导法瞬时转染哺乳动物CHO细胞，通过RT—PCR和Westernblot检测，最后通 过DNS(dinitrosalicylicacid)法测定表达产物酶学活性。PCR扩增得到的 目的序列与文献报道序列的相似 性为91％，预测的蛋 白氨基酸序列相似性为99％。RT．PCR和Westemblot检测证明，外源基因6 在 CHO细胞中得到表达；分泌到细胞培养上清中的重组蛋 白对水杨素的水解活性为 1．74u／mL，说明重组 蛋白具有B一葡萄糖苷酶活性。本研究克隆得到黑曲霉6 基因并在哺乳动物CHO细胞中进行表达，为 B一葡萄糖苷酶在单 胃动物中的利用提供了基础研究资料。 关键词 黑曲霉，B一葡萄糖苷酶BGL1，克隆表达，CHO细胞，酶活测定 CloningofaI3一glucosidaseGene (6 J7)from Asperjillusnige7．and ExpressioninChineseHamsterOvary(CHO)Cells HUANGMiao—Rong’ YANGJian—Hui LIUDe-Wu HUANGXiao—Ling CAIGeng—Yuan 、7 Zhen．Fang 1CollegeofAnimalScience,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642，China；2YueyangVocationalTechnicalCollege，Yueyang414000， China；3InstituteofAnimalScience，GuangdongAcademyofAgriculturalSciences，Guangzhou510642，China；4KeyLaboratoryofBiotechnology RDofVeterinaryBiologyProductsofGuangdongEnterprise，ZhaoqingDahuanongBiologyMedicineCo．，Ltd,Zhaoqing526238，China Correspondingauthor，wzfemail@163．com Abstract 3[-glucosidaseisoneofthethreemembersofthecellulasesystem andisconsideredtobethe rate—limitingenzymeofcellulosesaccharification．Theobjectiveofthestudywastoclonethe3[-glucosidase gene(bgl1)fromAsperjillusniger，andanalyzeitsexpressioninChinesehamsterovary (CHO)cells．The DNArfagme