大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定.pdfVIP

山东医药2011生第 鲞 24 大 鼠骨髓间充质干细胞的分离 、培养 及鉴定 周达岸 -2，郑洪新 ，李 静 (1辽宁中医药大学研究生学院，沈阳I10032；2辽宁医学院； 3辽宁医学院附属第三医院) 摘要：目的 体外分离、培养及鉴定大鼠骨髓间充质干细胞 (USe)。方法 全骨髓贴壁法体外分离、培养3月 龄 SD大 鼠MSC，利用差速贴壁原理纯化MSC，并通过形态学观察、细胞表面抗原标志物、多细胞系诱导分化对其进 行鉴定。结果 P3代不表达抗原CD 和CD ，表达抗原CD 和CD ，符合MSC表面标志物特征。P3代MSC定向 诱导后经ALP染色、矿化结节染色、油红0染色、Ⅱ型胶原荧光染色后鉴定具有骨向分化、脂向分化及软骨分化能 力。结论 全骨髓贴壁法能够建立稳定的MSC体外分离培养体系。 关键词：间充质干细胞；全骨髓贴壁法；流式细胞术 ；细胞分离 中图分类号：R394．2 文献标志码：B 文章编号：1002—266X(2011)24-0050-02 骨质疏松症 (OP)是 以低骨量和骨组织微细结 软骨分化诱导液：10～moL／LDex，37．5~Imol／L 构破坏为特征 ，致骨脆性增加 的一种全身性骨骼疾 VitC，6．25 g／ml胰岛素，50ng／mlTGF—p，2．5％ 病，具有高致残率和高病死率。2009年 12月 ～ FBS。 2010年 l2月，我们运用贴壁筛选法体外分离培养 1．4 SD大鼠MSC的分离、培养与传代 骨髓间充质干细胞 (MSC)，并对其进行鉴定，为探 1．4．1 全骨髓贴壁法 无菌条件下分离双下肢股 讨补 肾益髓中药含药血清干预OP大鼠MSC骨向分 骨，PBS冲洗 ，切除双侧干髓端。注射器吸取含 化提供理论基础 。 、 10％FBS的G．DMEM完全培养基5ml，加入 10％肝 1 材料与方法 素冲洗骨髓腔3～4次，吹打均匀，用含 10％胎牛血 1．1 实验动物 清洁级 SD大鼠12只，由辽宁医 清的G．DMEM完全培养液重悬细胞。调整细胞以1 学院实验动物中心提供。雌雄各半，3月龄，体质量 x10cells／m]密度接种于培养瓶 中，置 CO 培养 (250±10)g。 箱，每3d全量换液 1次。待贴壁细胞达到80％一 1．2 主要试剂 优级胎牛血清 (天津市灏洋生物 90％融合后，弃培养液 ，PBS清洗3次，胰酶 +EDTA 制品科技有限责任公司)，HEPES(美国AMRESC0 消化液室温下消化，以1：2比例传代。 公司分装)，胰岛素(江苏万邦生化医药股份有限公 1．4．2 细胞周期 取P3代 MSC，经胰酶 +EDTA 司)，吲哚美辛、1-甲基一3一异丁基．黄嘌呤 (美国Sig— 消化后，用PBS制成单细胞悬液，4oC预冷的冰乙醇 ma公司分装)，油红O(北京化工厂)，茜素红(国药 固定，离心，PBS洗2次，将细胞重悬于PBS中，加人 集团化学试剂有限公司)，噻唑兰 (美 国AMRESCO RNaseA20 ，37℃水浴，离心去上清，加人碘化丙 公司)，兔抗大鼠Ⅱ型胶原单克隆抗体(北京博奥森 啶，4oC避光染色，流式细胞仪检测，Multicycle软件 生物有限公司)，羊抗兔二抗试剂盒 (北京博奥森生 分析。 物有限公司)。 1．5 大鼠MSC鉴定 采用倒置相差显微镜进行 1．3 主要试剂配制方法 无菌条件定容至100ml， MSC形态学观察。采用直接免疫荧光法进