人源性Jagged1 RNAi慢病毒载体的构建及鉴定.pdfVIP

广东医学 2012年 4月 第33卷第 7期 GuangdongMedicalJournalApr．2012，Vo1．33，No．7 · 903 · 人源性 JaggedlRNAi慢病毒载体的构建及鉴定 张同韩 ，刘海潮 ，梁玉洁 ，梁立中 ，廖贵清 ，吴纪楠 ，黄洪章 广东省中山市人民医院口腔医疗中心 (广东中山528403)； 中山大学光华 口腔医学院、附属 口腔 医院 口腔颌面 外科 (广州 510055) 【摘要】 目的 构建人源性JaggedlRNAi慢病毒载体，并观察其对舌癌细胞 中Jaggedl的敲减作用。方法 GenBank检索人Jaggedl信息，设计 Jaggedl靶点。BLAST比对 同源性，合成双链 DNAoligo。线性化的RNA干扰载 体质粒 pAJ—U6一shRNA—CMV—eGFP／PumR，双酶切，与合成的双链DNAoligo连接 ，转化感受态细胞，选择 阳性 克隆进行鉴定。慢病毒三质粒系统共转染293T细胞，包装，纯化，并转染Tca8113以及 Cal27细胞，测定转染效 率。PCR及 WesternBlot检测Jaggedl基因及蛋白表达变化。结果 成功构建靶向JaggedlRNAi载体质粒，并成 功进行慢病毒包装。该系统可有效地感染Tca8113及 Ca127细胞。细胞内Jaggedl基 因及蛋 白表达均有明显下 调。结论 成功构建JaggedlRNAi慢病毒载体，为下一步研究Jaggedl在人舌鳞癌的中的作用机制奠定基础。 【关键词】 Notch信号；Jaggedl；舌癌；RNA干扰 ；慢病毒 ConstructionandidentificationofthehumanJaggedl—targetedl Aisystem onlentiviralvector． ZHANG 一 han ．LIUHai—chao，LIANGYu—j沈．LlANGLi—zhong，LIAO Gui—qing，WU Ji—nan，HUANGHong—zhang． DentalCenter，ZhongshanPeoplesHospital，Zhongshan，528403，China Correspondingauthor：L 0 Gui—qing．Tel：0086—20E—mail：drliaoguiqing@ hotmail．com ； U 一 nan．Tel：0086—20E—mail：gdwujn@163．tom A【bstract】 0bjective ToconstructhumanJaggedl—RNAilentiviralvector，andtoobservetheknocking—down effectintonguecancercells．M ethods HumanJaggedlinformationwasretrievedinGenBankandfordesignationofJag— gedlsilencetargets．AfterBLAsThomologycomparisontest．syntheticdouble—strandedDNAoligowasconstructed．Plas— midRNA interferencepAJ—U6一shRNA—CMV—eGFW PuroRwassubsequentlylinearized．digestedwithrestrictionen· zymesandrecombinedwiththesyntheticdouble—strandedDNAoligo．TherecombinantplasmidwastransfectedintoE． colicompetentcellsandselectedofrpositiveclones．293T cellswasinfectedwiththeJaggedlRNAiexpressionplasmid pAJ—U6一Jagged1一shRNA—CMV —eGFP／PuroR．Threelentiviral systemswereco—transfected into293T cells． Lentiviral vectorpackagedfrom 293Tcellswerepurified．Tca8113andCal27cellsweretransfectedwiththetoassessthe transfectionefficacy．RealtimePCR andWesternBlotwereusedtodetecti