A型产气荚膜梭菌中国标准株α毒素基因的克隆与序列分析.pdfVIP

维普资讯 2004，38(12)：5～8／陈小云，等 中国兽药杂志 A型产气荚膜梭菌中国标准株 毒素 基因的克隆与序列分析 陈小云，张存帅，关孚时 (中国兽医药品监察所，北京 100081) [收稿 日期]2004—11一O1 [文献标识码]A [文章编号]1002—1280(2004)12—0005—04 [中图分类号]$852．616．3 [摘 要] 应用聚合酶链式反应(PCR)技术，从A型产气荚膜梭菌中国标准株 C57—1中，扩增出 大小约1．2kb的A型产气英膜梭菌 毒素全基因(cpa1254基因)，并将其克隆入 pMD18一T载体 中。转化至受体菌DH5cx后，经Amp／IPTG／X—Gal选择培养，提取质粒，PCR和EcoRI／PstI双酶 切鉴定，筛选阳性重组克隆。核苷酸序列分析证实，cpa1254基因阅读开放框架由1194bp组成， 编码398个氨基酸残基。经GenBank数据库的BLAST检索比对分析，cpa1254基因序列与国外文 献报道者同源性达99％，表明本实验所克隆的cpa1254基因即为A型产气英膜梭菌 毒素基因。 [关键词] A型产气英膜梭菌；毒素；全基因；分子克隆；核苷酸序列 产气荚膜梭菌 (Clostridiumperfringens)是引起 终达到与国际标准方法相一致的目的，笔者试图利 各种动物坏死性肠炎、肠毒血症，人类的食物中毒 用PCR技术获得产气荚膜梭菌几种主要毒素的全 和创伤性气性坏疽的主要病原菌之一，广泛分布于 基因，进而对其进行体外表达，大量获取较纯粹的 土壤及动物的消化道 内。该菌能产生强烈的外毒 毒素蛋白，为最终研究出产气荚膜梭菌血清学鉴定 素和一些与侵袭力有关的酶类，有的菌株还可产生 的新方法和试剂奠定基础。现将中国标准株 C57—1 肠毒素、溶血素和血凝素等。到 目前为止，已发现 的 毒素全基因的克隆与鉴定结果报告如下： 的外毒素有 12种之多。根据它产生的4种主要外 1 材料与方法 毒素(、p、和L)的不同，可将其分为A、B、C、D、 1．1 菌株与载体 A型产气荚膜梭菌中国标准株 E5个型。各型菌均产生 毒素(CPA，又称磷酯酶 C57—1，本所保存；受体菌DH5cx，购自北京道普生物 C)，它是第一个被发现既有酶活性又有毒素特性的 技术开发中心；pMD18一T载体，购 自宝生物有限公 细菌蛋白，也是 A型产气荚膜梭菌的主要外毒素， 司。 被认为是最基本、最重要的毒力因子，在产气荚膜 1．2 试剂 细菌基 因组提取试剂盒 QIAamp@ 梭菌的致病过程中起着至关重要的作用。由A型 DNAMiniKit为QIAGEN公司产品；TaqDNA聚合 产气荚膜梭菌感染引起的各种动物疾病具有发病 酶、DL2000DNA分子量标准、限制性内切酶EcoRI 急，死亡快，死亡率高的特点，目前尚无有效的治疗 和风￡I、IPTG、X—Gal、dNTP等购 自宝生物有限公 方法。因此，免疫接种是预防该病的惟一途径。 司；氨苄青霉素、琼脂糖凝胶购 自Sigma公司；DNA 目前，羊梭菌病三联灭活苗的效力检验采用小 片段玻璃奶快速纯化 回收试剂盒购 自博大泰克生 白鼠中和试验的方法。该方法虽用不同型的菌株 物基因技术有限公司；质粒小量快速提取试剂盒购 毒素中和，用MLD表示，但不能确定对各毒素型和 自北京道普生物技术开发中心。 单位的保护效果，也与 《欧洲药典》中明确规定的检 1．3 产气荚膜梭菌基因组DNA的提取 参照细 验毒素的方法不一致。为改进我们的检验方法，最 菌基因组提取试剂盒的说明书进行，并稍作改进。 陈小云(1977年 ～)，男，博士，助理研究员，从事兽医生物制品的监