光谱法表征蛋白酶K的热变性过程.pdfVIP

第33卷，第7期 光谱学与光谱分析 201 3年7月 and Spectroscopy SpectralAnalysis July，2013 光谱法表征蛋白酶K的热变性过程 张奇兵，那馨竹，尹宗宁+ 四川大学华西药学院靶向药物与释药系统教育部重点实验室，四川成都610041 摘要用不同温度处理蛋白酶K，以变性酪蛋白底物法测定酶活力，稳态／瞬态荧光光谱法和圆二色谱法 测定空间构象和二级结构，研究温度对蛋白酶K酶活力和构象的影响。温度由25℃升高至65℃过程中，蛋 rla-Tl红移至354 白酶K的酶活力逐渐降低，半衰期缩短；发射光谱荧光强度降低，峰位由335 nln；色氨酸残 1 4 基同步荧光强度降低，酪氨酸残基同步荧光强度增大；色氨酸残基荧光寿命由4．427ItS降低至4．032 ns；旷螺旋百分含量降低。结果表明：采用稳态／瞬态荧光光谱法和圆二色谱法能较简便、准确的描述蛋白酶 K的热稳定性变化；蛋白酶K的热变性过程符合三态模型，存在～个中间态；蛋白酶K分子内部存在酪氨 酸残基对色氨酸残基的共振能量转移作用；r螺旋是维系蛋白酶K活性中心构象稳定性的主要结构。 关键词蛋白酶K；热稳定性；稳态荧光光谱；瞬态荧光光谱；圆二色谱 中图分类号：Q55 文献标识码：A DOI：10．3964／j．issn．1000—0593(2013)07—1749—05 对蛋白质的生产、储存以及在医药和工业上的应用具有一定 引 言 指导意义。 随着蛋白多肽类药物的不断发展，溶液中蛋白质的稳定 1实验部分 性越来越被人们所重视D』，常见的影响因素有温度、pH、变 性剂、有机溶剂、压力、离子强度等[2]。对蛋白质变性和去 1．1试剂与仪器 折叠过程的研究有助于从深层次了解蛋白质的稳定性[1’…。 蛋白酶K(EC3，4．21．64)来源于辣伯氏白色念珠菌，属 三氯乙酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)；三羟甲基氨基 于丝氨酸蛋白酶家族[4]。该酶具有较强的蛋白水解活性，常 甲烷(广东光华化学厂有限公司)。 用于诊断朊病毒病、分离纯化DNA／RNA时去除DNA／ UVlooo紫外可见分光光度计(上海天美科学仪器有限 RNA酶、添加到洗衣粉中降解污渍蛋白等[5“]。酶活性中心 由僵化三联体Asp39一His69一Ser224组成，底物识别和结合部 400 位由G100一Y104和$132 G136两个片段构成L6J。蛋白酶K圆二色光谱仪(AVIV)；GENIUS16K-M台式微量高速离心 仅有一条肽链，由277个氨基酸残基组成，分子量为机(长沙市鑫奥仪器仪表有限公司)；LabDancer(1KA)； 28930Da；含有两个二硫键(34-124，179—248)，两个色氨酸 残基(trp-8，trp-212)和17个酪氨酸残基[4]。 TORIUS)；FiveEasy pH计(M朋可LER Liu[5]等研究了ca2+对蛋白酶K的影响；Tomar等[71研 501A型超级恒温循环槽(上海一恒科技有限公司)。 究了烷基醇对部分去折叠态蛋白酶K的影响；Pe