單元七：質體DNA的分析.pdfVIP

單元單元七：七 ：質體質體 的分析的分析 單元單元七七 ：：質體質體 DNA 的分析的分析 一、一 、實驗目的實驗目的 ： 一一 、、實驗目的實驗目的 學習以限制酶切割及瓊脂膠體電泳分析的方法分析DNA 。 二、二 、前言前言 二二 、、前言前言 限制酶是由微生物所產生的內切核酸酶(endonuclease) ，有防禦的功能 ，能破 壞外來的噬菌體DNA ，保護自己。由於限制酶有辨識特定DNA序列並加以切割的 特性 ，所以成為很好的DNA剪接工具 ，目前已被廣泛的應用。 限制酶名稱的前三個字母表示產生此酵素之微生物名稱，第四個字母表示菌 株，最後的羅馬數字表示此種菌株來源之第幾種酵素。例如，限制酶「EcoRI 」的 Eco表示來自大腸桿菌Escherichia coli R代表菌株名RY13 I代表第一種酵素 。 每一種限制酶能辨識一種特定的DNA 序列，且此序列有軸對稱性。例如EcoRI 所能辨識的 序列為 ： DNA 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5 此二股 由 端讀起 ，序列都相同 ，當一段 中有此序列存在時 DNA 5 DNA EcoRI 就會將此序列 間的鍵結切開，此段 就斷開了成為二段。 GA DNA 5 G 3 5 AATTC 3 3 CTTAA 5 3 G 5 由於當我們要把特定的DNA 片段接到載體上時，就可用限制酶先切割目標DNA 片段及載體 ，產生互補的單股 尾巴，再以 連結酶 連結即可。 DNA DNA DNA (ligase) 在之前實驗中我們所抽取的質體DNA 中，嵌有一段螢光基因，在本次實驗中，我 們將以限制酶處理 ，將此螢光基因切出。 當我們要分析或分離不同大小的 片段時 ，瓊脂膠體電泳 DNA (agarose gel 是一個很常用的方法。將 放入瓊脂膠體中，通電後，由於 electrophoresis) DNA DNA 帶負電，因此在電場中會向正極移動 而愈大的DNA 片段移動之速度愈慢，所以 經一段時間的電泳後，不同大小的 片段便在膠體中分離開來了。我們無法直 DNA 接看到膠體中的DNA ，必須先以ethidium bromide 處理 ，再以紫外光照射，才能 看到 。 是一種很毒的致癌劑是一種很毒的致癌劑 ，處理時一定要戴手套，處理時一定要戴手套 ，絕對不要，絕對不要 Ethidium bromide 是一種很毒的致癌劑是一種很毒的致癌劑 ，，處理時一定要戴手套處理時一定要戴手套 ，，絕對不要絕對不要 沾到自己身上沾到自己身上 ，也不要弄的到處都是，也不要弄的到處都是 。 沾到自己身上沾到自己身上 ，，也不要弄的到處都是也不要弄的到處都是 本部份實驗要讓大家學習以瓊脂膠體電泳的方法 ，分析限制酶處理後質體 DNA 。 三、三 、實驗材料實