陆地棉黄萎病菌诱导抑制消减杂交cDNA文库的构建与分析.pdfVIP

维普资讯 江苏农业学报 (JiangsuJ．0厂Agr．Sci．)，2008，24(1)：17～21 17 陆地棉黄萎病菌诱导抑制消减杂交 eDNA文库的构建 与分析 张映霞 ， 杨郁文 ，倪万潮 ， 曹祥荣 ， 沈新莲 (1．南京师范大学生命科学学院，江苏 南京 210097；2．江苏省农业科学院农业生物技术研究所，江苏 南京 210014) 摘要：为探明棉花黄萎病抗性的相关基 因，对本实验室的一个高抗黄萎病陆地棉材料进行抑制消减杂交 (SSH)，以黄萎病菌诱导后48h和未诱导的植株分别作为Tester和 Driver，提取总 RNA并分离mRNA，通过合成 cDNA双链及两次PCR扩增，富集诱导后植株中差异表达的片段。对两次PCR后的产物纯化，连接并转化到大肠 杆菌中完成文库构建，共获得了434个阳性克隆。对插入片段进行PCR扩增后发现大小从0．45kb到0．70kb不 等。指纹图谱分析将所有克隆分为20类，于每一类中取 1个克隆进行测序分析。BLAST分析表明大部分克隆片 段与其他病原菌诱导缩减库中的EST相似。缩减片段编码的蛋白与拟南芥的P450单加氧酶、病程相关蛋白、类甜 蛋白以及几丁质酶等相似。此cDNA文库的建立为进一步分析基因的差异表达及分离抗黄萎病基因奠定了基础。 关键词： 棉花；黄萎病；抑制消减杂交；cDNA文库 中图分类号： $435．621．24 文献标识码： A 文章编号： 1000d4dO(2008)Ol-0017-05 ConstructionandAnalysisofA SSH LibraryofUplandCottonUpon In— fectionwithVerticillium dahliae ZHANG Ying．xia一， YANG Yu．wen ， NIWan．chao ， CAO Xiangrong ， SHEN Xin1ian (1．CollegeofL Science，NanfingNormalUniversity，M ng210097，China；2．InstituteofAgro—biotechnology，JiangsuAcademyofAgriculturalSci ∞c ，ⅣⅡnjing210014，China) Abstract： Toexplorediseaseresistant—relatedcandidategenesofVerticillium wiltfrom uplandcotton。ahigh Verti— cillittmwiltresistantcottoncuhivarwasusedforconstructionofasuppressionsubstrativehybridization(SSH)library．The cDNAsrfom theinoculatedseedlings48hafterdiseaseinoculationwereusedasthetesterandthoserfom thecontrolseed 1ingsasthedriver．ThetotalRNA andmRNA weresuccessfullyisolatedusingamethodofmodifiedCTAB，followedbythe synthesisofdoublestrandcDNA．AftertworoundsofPCR，theup—regulatedrfagmentsrespondingforinductionofVerticilli一 [tm wiltwereaccumulatedintheSSH library．ThepurifiedPCRproductswereligatedtothevectorandtransfefredintoE． coli．434cloneswith0．45kbto0．70kbinsertswere0btained．A1lthecloneshavebeengroupedto20 kindsbvfinger— printingandeachcloneofeverykindwaschosentobesequenced．SequencewereblastedtoNCBIdatabase