青霉素效价的生物测定.pdfVIP

青霉素效价的生物测定 【目的】 1.了解用杯碟法测定抗生素效价的原理。 2.掌握青霉素效价生物测定的具体操作步骤与方法。 【概述】 抗生素的抗菌特性决定了它的医疗价值，因此，利用他们各自的抗菌活性来测定其效价 有着重要的意义。效价的测定法有：液体稀释法、比浊法和扩散法等。本实验采用国际上最 常用的杯碟扩散法来测定青霉素的效价。测定时，将规格完全一致的不锈钢小管 （即牛津小 杯）置于含敏感菌的琼脂平板上，并在牛津小杯中加入已知浓度的标准青霉素溶液和未知浓 度的青霉素发酵液。于是，抗生素就自牛津小杯处向平板四周扩散，在抑菌浓度所达范围内 敏感菌的生长被抑制而出现抑菌圈。在一定的范围内，抗生素浓度的对数值与抑菌圈直径呈 线性关系。因此，只要将被测样品与标准样品的抑菌圈直径进行比较，就可在标准曲线上查 得未知样品的抗生素效价值，为科学实验或临床应用提供参考依据。 【材料和器皿】 ⑴菌种：金黄色葡萄球菌 （Staphylococcus ），产黄青霉 （Penicillium chrysogenum ）。 ⑵培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 （作生物测定用时，平板应分上下两层，上层需另 加0.5%葡萄糖）。 ⑶试剂 ①1%pH6 磷酸缓冲液：K HPO 0.2g(或 K HPO ·3H O0.253g) ，K HPO 0.8g ，蒸馏水 2 4 2 4 2 2 4 100ml。 ②0.85%Nacl 生理盐水溶液。 ③苄青霉素钠盐：1.667U/mg （1U 即1 国际单位，等于0.6ug ）。 ⑷其他：牛津小杯[不锈钢小管，内径 （6+0.1 ）mm ，外径 （8+0.1 ）mm ，高 （10+0.1 ） mm] ，培养皿 （直径90mm，深20mm ；大小一致，皿底平坦），试管、滴管、移液管 （5、 1ml）及大口10ml 移液管等。 【方法和步骤】 1. 敏感菌悬液的制备 ⑴保藏与传代：将测定用的金黄色葡萄球菌在新鲜斜面培养基上传代并保存。注意测定 用敏感菌应每隔3 周传代一次，菌种可在37℃温箱培养18～20h后，再在室温下置放3～ 4h，使菌种斜面产生良好的色素，然后将其置于4℃冰箱保存。 ⑵活化：在使用前先将供试菌株在斜面培养基上连续传代3～4次，使菌种充分恢复其 生理性状。 ⑶制备悬液：将活化的敏感菌斜面，用0.85%生理盐水洗下，经离心后去除上清液，再 用生理盐水洗涤1~2 次，并将其稀释至一定浓度的悬液。 2 ．青霉素标准溶液的配制 （1 ）青霉素标准母液：准确称取纯苄青霉素钠盐 15~20mg, ，溶液在一定量的 0.2mol/LpH6 磷酸缓冲液中，使成2000U/ml 的青霉素溶液，然后保持冷藏存放。 （2 ）青霉素标准工作液：使用时以标准母液配成 10U/ml 青霉素标准测定液，按表 I-15-5- 1 加入青霉素标准母液，即配成不同浓度的青霉素标准液。 ○ 表Ⅰ—15—5—① 不同浓度标准青霉素液的配法 -1 试管编号 10U/ml 工作液量/ml Ph6 磷酸盐缓冲液 青霉素含量/(U ·ml ) /ml 1 0.4 9.6 0.4 2 0.6 9.4 0.6 3 0.8 9.2 0.8 4 1.0 9.0 1.0 5 1.2 8.8 1.2 6