实时荧光定量PCR方法检测急性髓系白血病FLT3基因mRNA的表达.pdfVIP

维普资讯 广东医学 2008年3月第29卷第3期 G岫皿gd0ngMedicalJournal Mar．2008，Vo1．29，No．3 · 377 · 实时荧光定量 PCR方法检测急性髓系 白血病 FLT3基 因mRNA的表达 ：Ic 唐家宏 徐兵 宋小燕 胡斌 南‘方医科大学南方医院血液科(广州510515)； 中山大学达安基因诊断中心(广州 510080) 【摘要】 目的 构建检测急性髓细胞 白血病 FLT3基因mRNA表达的标准品重组质粒和荧光定量PCR方 法，为进一步研究FLT3基因表达与急性髓细胞 白血病的关系奠定基础。方法 利用引物设计软件设计 出扩增 FLT3基因的引物和特异性荧光探针，提取 l62细胞株总RNA，经RT—PCR扩增，产物纯化后与pUCm—TVector 连接，转化到大肠杆茵DH5ct，筛选得到标准品的质粒 FLT3P。建立荧光定量PCR检测 FLT3基 因技术方法，建立 标准曲线并检测 15例初治AML患者。结果 重组质粒进行荧光定量PCR扩增出现强烈的荧光值增长，表明 FLT3cDNA已成功克隆。以10。一10copies／ 不同稀释水平的标准品进行荧光定量PCR扩增，所获得的Ct值 与标准品浓度的对数存在 良好线性关系，标准曲线回归系数为0、9998。AML病例 FLT3表达水平显著高于正常 对照组 (P=0．017)，且不同病例的表达水平存在较大差异。结论 成功构建用于定量检测 FLT3mRNA表达的 荧光定量PCR标准品和技术方法；AML病例 FLT3表达水平显著增高。 【关键词】 白血病，髓细胞，急性 基因，FLT3 PCR，实时定量 ThedetectionofFLT3mRNA expressioninpatientswithacutemyeloidleukemiabyreal—timequantitativepoly- merQ~ chainreactionamplification TANG肋 一 ，lg，XU历 ，SONGXuw—yan，etal、Departmentofttematolo— gY，NanfangHospital，theSouthernMedicalUniverstiy，Guangzhou510515China 【Abstract】 Objective ToconstructrecombinantplasmidnadstnadardcurvefordetectionofFLT3geneexpres— sionnadtoestablishreal—timequnatitativepolymerasechainreaction(PCR)assayforthedetectionofacutemyelocytic leukemia(AML)、Methods Theprimerexpressionsoftwarewas usedtoobtainacoupleofprimet8nadfluorescent probes．RNA was extractedfrom theK562ceHsnadFLT3cDNAwas amplifiedbyRT—PCR ．ThePCRproductwas con— nectedwithpUCm —TvectorandsubseuqentlytransferredintoEcoilDH5ct．Th estandardrecombinna tplasmidwasgained from thepositiveplasmid．Th estnadardcurvereal—timequna titativePCRmethodwas establishedtodetectFLT3geneex- pressionin15newlydiagnosed AMLpatients．Results Th efluorescencelevelssignificontlyincreasedafterreal —time uq natitativePCR ma plification，indicatingcloningofFLT3cDNA．Th eCT valuewas 13．108，16．6O9，20．107，23．618 nad27．109respectivelywith10 一10’copies／ standard cDNA speci