蛋白质的含量测定.pptVIP

蛋白质的含量测定 (一)、蛋白质分子的相对分子质量 蛋白质是相对分子质量（relative molecular mass, Mr）很大的生物大分子，其Mr变化范围在6 000—1 000 000 或更大一些。 相对分子质量测定：根据化学组成测定最低Mr; 渗透压法测定相对分子质量; 超离心法测定相对分子质量; 凝胶过滤法测定相对分子质量; SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量 （二）蛋白质的两性电离 蛋白质是由氨基酸组成，其分子末端除有自由的α-NH2和α-COOH外，许多氨基酸残基的侧链上尚有可解离的基因，这些基团在溶液一定pH条件下可以解离成带负电荷或正电荷的基团。当蛋白质溶液在某一pH时，蛋白质解离成正负离子的趋势相等，即成兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点（isoelectric point,PI）。蛋白质溶液的pH大于等电点时，该蛋白质颗粒带负电荷，小于等电点时则带正电。 电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。 电泳种类：自由界面电泳、区带电泳（纸电泳、凝胶电泳等） （三）蛋白质的胶体性质 蛋白质是生物大分子，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1～100nm，为胶粒范围之内。蛋白质溶液是相当稳定的亲水胶体，因为蛋白质颗粒外面形成一层水化层，同时这些颗粒带有相同电荷，相互排斥。蛋白质水溶液具有胶体溶液的特征。 （四）蛋白质的沉淀反应 如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层（消除相同电荷，除去水膜），蛋白质胶体溶液就不再稳定并将产生沉淀。 加高浓度盐类（盐析、盐溶） 加盐使蛋白质沉淀析出－－盐析 加有机溶剂 加重金属盐 加某些酸类（生物碱试剂） 单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸能沉淀生物碱，称生物碱试剂。 （五）蛋白质的变性、复性与凝固 在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失，称为蛋白质的变性(denaturation)。 1． 蛋白质变性的特征：蛋白质变性的主要特征是生物活性丧失。 2． 蛋白质变性的本质：一般认为蛋白质的变性主要发生二硫键和非共价键的破坏，蛋白质变性是蛋白质空间构象的改变或破坏，不涉及一级结构中氨基酸序列的改变。 3． 蛋白质变性的意义：在临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。此外, 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂(如疫苗等)的必要条件。 4. 若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，有些蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation)。所示。但是许多蛋白质变性后，空间构象严重被破坏，不能复原，称为不可逆性变性。 5. 蛋白质经强酸、强碱作用发生变性后，仍能溶解于强酸或强碱溶液中，若将pH调至等电点，则变性蛋白质立即结成絮状的不溶解物，此絮状物仍可溶解于强酸和强碱中。如再加热则絮状物可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中，这种现象称为蛋白质的凝固作用(protein coagulation)。 (六)蛋白质的紫外吸收 蛋白质在远紫外光区（200-230nm）有较大的吸收，在280nm有一特征吸收峰，可利用这一特性对蛋白质进行定性定量分析。 （七）蛋白质的呈色反应 ⒈茚三酮反应(ninhydrin reaction) 蛋白质经 水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。 ⒉ 双缩脲反应(biuret reaction) 蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，称为双缩脲反应。氨基酸不出现此反应。 引言：蛋白质的定量分析是生物化学和其他生命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品，药物、食品质量检测的重要指标。在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作。 测定蛋白质含量的方法较多 基本上都是根据蛋白质的理化性质和生物学活性建立起来的。 目前常用的有四种古老的经典方法:定氮法,双缩脲法( Biuret法) Folin -酚试剂法( Lowry 法)和紫外吸收法.另外还有一种近十年才普遍使用起来的新测定方法,考马斯亮蓝法( Bradford法).其中Bradford 法和 Lowry 法灵敏度高，比紫外吸收法高10-20倍,比 Biuret 法高100倍以上.凯氏定氮法比较复杂,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 一、凯氏定氮法： 根据蛋白质的含氮量来测定蛋白质的含量。 公式:每g样品中含氮克数 × 6.25 ×100 二、比色法：