一种重组人睫状神经营养因子突变体的分离纯化及结构鉴定.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３３（１０）：２１２７ 一种重组人睫状神经营养因子突变体的 分离纯化及结构鉴定 １ ２ ３ ４ １ ２ ２ 冯　翠 　赵大伟 　张　纯 　王　健 　秦培勇 　刘永东 　苏志国 （１北京化工大学生命科学与技术学院　北京　１０００２９　２中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室　北京　１００１９０） （３四川大学华西药学院　成都　６１００４１　４北京生物制品研究所有限责任公司　北京　１０００２４） 摘要　研究并建立从细胞破碎上清中获得一种含游离半胱氨酸的重组人睫状神经营养因子突变 １７ 体（ＣＮＴＦＣ ）的分离纯化方法并对纯化产物的结构及活性进行表征。通过疏水层析、离子交换 １７ 和亲和层析的组合层析路线，能实现目标蛋白与其它杂蛋白的有效分离。组合层析后 ＣＮＴＦＣ 的纯化倍数可达１１．４，收率３５．５％。反相高效液相色谱和凝胶过滤层析证明产物纯度可达到 ９８％以上，且以单体形式稳定存在，无分子间二硫键结合的二聚体。质谱测得产物分子量与理论 值一致，圆二色光谱和荧光光谱证明纯化产物具有正确的二、三级结构，ＴＦ１．ＣＮ５ａ．１细胞增殖活 ６ 性检测表明纯化产物比活达到２．１×１０ＩＵ／ｍｇ。因此，为这种新的ＣＮＴＦ突变体规模化生产及后 续应用奠定了基础。 关键词　重组人睫状神经营养因子　半胱氨酸　可溶表达　分离纯化　组合层析 中图分类号　Ｑ５０３ 　　睫状神经营养因子（ｃｉｌｉｎａｒｙｎｅｕｒｏｎｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ， 更好的稳定性和更小的免疫原性［６７］。ＡＸ１５在体内的 ＣＮＴＦ）是一种多功能细胞因子，能促进体内神经元的 循环半衰期很短，采用聚乙二醇修饰可延长其体内停 ［８９］ 存活，防止神经损伤，促进神经纤维再生及细胞分 留时间 。目前最常使用的蛋白定点修饰策略是采 ［１］ 用ＰＥＧ醛在ｐＨ５左右的酸性条件下对蛋白Ｎ末端进 化 。ＣＮＴＦ的功能研究及临床试验表明，ＣＮＴＦ为治 疗帕金森 （Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｄｉｓｅａｓｅ，ＰＤ）、阿尔茨海默 行修饰；但是，ＡＸ１５在 ｐＨ值小于６．０时极易聚集沉 （Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）、肌萎缩性脊髓侧索硬化 淀，以此为基础开发ＰＥＧ定点修饰长效制剂存在困难， （ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃｌａｔｅｒａｌｓｃｌｅｒｔｏｓｉｓ，ＡＬＳ）等神经性疾病带来 很难高效获得定点均一的ＣＮＴＦ修饰产品。为此，我们 １７ 希望，同时已有研究表明ＣＮＴＦ能降低小鼠体重，因此 构建了一种新的ＣＮＴＦＣ突变体，保留天然序列中１７ ［２３］ 位半胱氨酸，仅突变６３位谷氨酰胺为精氨酸并去掉 Ｃ 在减肥方面的应用也备受青睐 。 　　天然 ＣＮＴＦ含２００个氨基酸，分子量２３ｋＤａ，等电 末端的１５个氨基酸，希望以此为基础探索 ＣＮＴＦ的巯 点５．８左右，仅在第１７位有一个半胱氨酸，分子内无二 基定点修饰产品。ＡＸ１５在重组大肠杆菌中以包涵体 ［４５］ １７ ６３ １７ 硫键、无 Ｎ糖基化位点和信号肽 。ＡＸ１５（Ａ Ｒ 形式表达，而这种新的ＣＮＴＦＣ 突变体在大肠杆菌中 １５）是目前研究最多的一种ＣＮＴＦ突变体，它去掉了天 则主要以可溶形式表达。本文