国境口岸沙门氏菌、志贺氏菌、O157：H7的三重实时荧光PCR检测方法.docVIP

前 言 本标准依据GB/T1.1-2009给出的规则编写。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国出入境检验检疫局中华人民共和国出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：、、 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。国境口岸沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157:H7的三重荧光PCR 检测方法 范围 本标准规定了国境口岸沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157:H7三重荧光PCR检测的对象，标本的采集、运输和保存，操作方法及结果报告。 本标准适用于国境口岸沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157:H7的筛选检测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4789.17-2003 食品卫生微生物学检验 肉与肉制品检验 GB/T 4789.18-2010 食品卫生微生物学检验 乳与乳制品检验 GB/T 4789.19-2003 食品卫生微生物学检验 蛋与蛋制品检验 GB/T 4789.21-2003 食品卫生微生物学检验 清凉饮料检验 GB/T 4789.22-2003 食品卫生微生物学检验 调味品检验 GB/T 4789.23-2003 食品卫生微生物学检验 冷食菜、豆制品检验 GB/T 4789.24-2003 食品卫生微生物学检验 糖果、糕点、果脯检验 GB 19489-2008 实验室 生物安全通用要求 SN/T 1193 基因检验实验室技术要求 WS/T 230-2002 临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 沙门氏菌 Salmonella 沙门氏菌属肠杆菌科，革兰氏阴性杆菌。菌体大小0.7～1.5μm×2.0～5.0μm,无芽胞，一般无荚膜，除鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌外，大多有周身鞭毛。包括那些引起食物中毒，导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌。甚至可导致严重脱水以及急性肾功能衰竭而亡。 3.2 志贺氏菌 Shigella 志贺氏菌属肠杆菌科，革兰氏阴性杆菌。大小为0.5～0.7×2～3μm，无芽胞，无荚膜，无鞭毛。多数有菌毛。是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌。志贺氏菌所致菌痢的病情较重，以全身中毒症状和下部大肠化脓性炎症为主要特征，严重者可发生感染性休克和(或)中毒性脑病。 3.3 大肠杆菌O157:H7 Escherichia coli O157:H7 大肠杆菌O157:H7属肠杆菌科埃希氏菌属属肠杆菌科，革兰氏阴性杆菌。大小0.4μm～0.7μm×1μm～3um，无芽胞，有普通菌毛与性菌毛。可致人腹泻、出血性结肠炎，5%～10%的病例并发溶血性尿毒综合征（HUS）及血栓性血小板减少紫癜(TTP)等。 3.4 荧光PCR fluorescence polymerase chain reaction 又称为实时荧光PCR（real-time PCR），实时荧光PCR方法有多种，本标准采用的是TaqMan水解探针法，其原理是在常规PCR的基础上，加入一条特异性的荧光探针，该探针为一条寡核苷酸，两边分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩增时，利用Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切水解，使荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，信号的强度与检测对象的核酸含量成正比，可根据数学模型计算出检测对象的含量。 3.5 Ct值 cycle threshold 即循环阈值，指每个反应管内所检测到的荧光信号刚好达到设定的阈值时所经历的循环数。 缩略语 下列缩略语适用于本标准： 4.1 PCR Polymerase Chain Reaction 聚合酶链反应 4.2 DNA deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸 4.3 Taq酶 Taq DNA polymerase Taq DNA聚合酶 4.4 MGB minor groove binder 小沟结合物，一种荧光淬灭基团。 检测对象 5.1 疑似沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157:H7感染者的临床标本如粪便。 5.2 疑似沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157:H7污染环境标本如水样，以及食品。 生物安全和PCR防污染要求 实验室生物安全应符合GB 19489的规定。PCR防污染措施按WS/T 230和SN/T 1193的规定执行。 仪器与器材 7.1 实时荧光定量PCR仪及配套PCR反应管。 7.2 生物安全柜。 7.3 高速台