国境口岸辛德毕斯病毒的检测方法 编制说明.docVIP

出入境检验检疫行业标准草案编制说明 1 基本信息 1.1 标准草案名称 中文 英文 1.2 与国际标准和国外先进标准一致程度情况 等同 修改 非等效 标准号 英文名称 中文名称 1.3 任务来源 批准立项的文件名称和文件号 关于下达2012年第一批出入境检验检疫行业标准制(修)订计划项目的通知计划编号 201B161 1.4 制（修）订情况 制订 修订 替代的标准编号 1.5 起止时间 年月～年月 1.6 起草单位 1.7 起草人 1.8 专业类别 卫生检疫 1.9 标准体系表代码 1.10 调整情况 2 背景情况 2.1 目的、意义 2.2 与国内外相关标准、文献的关系 1、通过查新，目前国内外尚无相同的国家标准和行业标准或已立项未批准发布的检验检疫行业标准。 2、按照GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则进行编写。 3、辛德毕斯病毒检测的相关国内文献有： 梁国栋，李其平，何英等. 我国首次分离到辛德毕斯病毒. 病毒学报，1993，9：55-59 李蕾，梁国栋，周国林等. 我国首次分离的辛德毕斯病毒（XJ-160病毒株）全基因组核苷酸序列测定. 病毒学报，2000，16：102-105 何丽芳，徐丽宏，曹玉玺等. 辛德毕斯病毒荧光PCR检测方法的建立. 中华实验和临床病毒学杂志，2005，4：347-352 王力华，梁国栋. 辛德毕斯病毒基因组结构与功能研究进展. 中国病毒学，2005，2：209-215 Jost et al. Isolation and Phylogenetic Analysis of Sindbis Viruses from Mosquitoes in Germany. Jounal of Clinical Microbiology, 2010, 48(5): 1900-1903 Sane et al. Development and evaluation of a real-time RT-PCR assay for Sindbis virus detection. Journal of Virological Methods, 2012, 179:185-188 3 编制过程 3.1 准备阶段（可选项） 3.2 分工情况 3.3 标准草案编写情况 3.4 征求意见情况（适用于送审稿） 3.5 审定情况 （适用于报批稿） 3.6 预期的管理目标（适用于规程类标准）或技术指标（适用于方法类标准） 5×103copies/mL，CV值小于5%，重复性好。 4 主要技术内容的确定 1 主要仪器设备 荧光定量PCR仪、普通PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等。 2 主要试剂 RNA提取试剂盒、实时荧光PCR试剂盒、逆转录PCR试剂盒等。 以GenBank检索的辛德毕斯全基因组序列(登录号NC 001547.1)，进行RT-PCR的引物和实时荧光PCR的引物与探针设计。 实时荧光RT-PCR检测的引物和探针： 上游引物: 5’- GTTCCTACCACAGCGACGAT -3’ 下游引物: 5’- TGATACTGGTGCTCGGAAAACA -3’ 探针序列: 5’FAM- TTGGACATAGGCAGCGCA –BHQ1 3’ 逆转录PCR检测的引物：上下游引物扩增核酸片段长度为 563 bp。 上游引物: 5’- ACCACTTGACATTGCTCAC -3’ 下游引物: 5’- GTCTACCTTCGCCAGGTA -3’ 3 阳性对照 通过基因工程构建的辛德毕斯病毒质粒作为阳性对照。 4 检测4.1 实时荧光RT-PCR检测程序 4.1.1 反应体系 设置25 μL反应体系，每个待检样本反应液的组成为：无RNA酶的灭菌双蒸水 5.2 μL， RT-PCR Mix 12.5 μL，20 μM上游引物 0.5 μL，20μM下游引物 0.5 μL，20μM 探针 0.3 μL，RT-PCR 酶 1.0 μL，模板RNA 5.0 μL。 4.1.2 扩增程序 在Bio-Rad CFX96实时荧光PCR仪上检测时，扩增程序为：45℃、10min，1个循环；95℃、15min，1个循环；95℃、15sec→60℃、30sec（检测荧光信号），40个循环。 由于不同的荧光定量PCR 仪性能有差异，必要时扩增程序可做适当调整。 4.1.3 结果判定 反应结果应同时符合阴性对照无扩增曲线而阳性对照Ct≤35 并有明显扩增曲线2个条件，否则，实验结果无效。 阴性结果：样品无Ct值或Ct40，且无明显扩增曲线，为辛德毕斯病毒核酸实时荧光RT-PCR检测阴性。 阳性结果：样品Ct值≤35