国境口岸辛德毕斯病毒的检测方法.docVIP

ICS FORMTEXT FORMTEXT 点击此处添加中国标准文献分类号 FORMTEXT FORMTEXT SN 中华人民共和国 FORMTEXT 出入境检验检疫行业标准 FORMTEXT SN/T FORMTEXT XXXXX— FORMTEXT XXXX FORMTEXT FORMTEXT 国境口岸辛德毕斯病毒的检测方法 FORMTEXT Detection of Sindbis virus at frontier port FORMTEXT 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 FORMDROPDOWN FORMTEXT （本稿完成日期：2013-9-25） FORMTEXT XXXX - FORMTEXT XX - FORMTEXT XX发布 FORMTEXT XXXX - FORMTEXT XX - FORMTEXT XX实施 FORMTEXT 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 SN/T XXXXX—XXXX PAGE \* MERGEFORMAT 3 前言 本标准按照GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国四川出入境检验检疫局、北京出入境检验检疫局、重庆出入境检验检疫局、广东出入境检验检疫局、山东出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：赵锋、刘杨、钟玮、郭慧萍、张华荣、张丽杰、洪烨、王颖、骆星丹 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 国境口岸辛德毕斯病毒的检测方法 范围 本标准规定了国境口岸入出境人员或蚊类携带辛德毕斯病毒的实时荧光PCR和逆转录PCR检测方法，包括标本采集、处理、检测程序和结果判定。 本标准适用于国境口岸入出境人员或捕获的蚊类携带辛德毕斯病毒的实验室检测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489　实验室生物安全通用要求 WS 233 微生物和生物医学实验室生物安全通用准则 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 辛德毕斯病毒 Sindbis virus 辛德毕斯病毒（Sindbis virus, SINV）属于披膜病毒科（Togaviridea）甲病毒属（Alphavirus），为单股正链RNA 病毒，分子量约4.3× 106Da，沉降系数为42S～49S，具有真核 mRNA 的典型特征，裸RNA具有感染性。辛德毕斯病毒在自然界中的宿主范围广泛，主要以库蚊和伊蚊为传播媒介，临床表现主要为发热、 HYPERLINK /wiki/%E8%84%91%E8%86%9C%E7%82%8E \o 脑膜炎 脑膜炎、 HYPERLINK /wiki/%E8%84%91%E7%82%8E \o 脑炎 脑炎、皮肤损害、抽搐、肌无力和皮疹等。 3.2 实时荧光RT-PCR real-time fluorescence RT-PCR 实时荧光RT-PCR方法有多种，本标准采用的是TaqMan水解探针法，其原理是在常规RT-PCR的基础上，加入一条特异性的荧光探针，该探针为一段寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩增时，利用Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切水解，使荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号，即每扩增一条DNA 3.3 RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction 逆转录聚合酶链式反应，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）将一条RNA链逆转录成为互补DNA，再以此为模板，由依赖DNA的DNA聚合酶通过PCR进行扩增。 3.4 Ct 值 cycle threshold 循环阈值，每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。 4 检测对象 疑似感染的入出境人员血清和入出境交通工具、集装箱、货物以及口岸等场所捕获的媒介蚊虫。 5 实验室生物安全要求 RNA提取和病原体检测应在生物安全二级（BSL-2）及以上实验室进行，实验室应遵循GB 19489和WS 233 对生物安全二级（BSL-2）及以上实验室的生物安全要求。 6 主要仪器设备 荧光定量PCR仪、普通PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、二级生物安全柜、高压灭菌器、-70℃ 7 主要试剂 7.1 样本制备及检测试剂：青霉素、链霉素、Hank’s液、无水乙醇、琼脂糖、Goldview、20U/μL RNA酶抑制剂、200U/μL M