禽衣原体病检疫技术规范 送审稿.docVIP

前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准代替了SN/T 1395.1-2004《禽衣原体间接红细胞凝集试验方法》、SN/T 1395.2-2005《禽衣原体病琼脂免疫扩散试验操作规程》和SN/T 1395.3-2005《禽衣原体病间接补体结合试验操作规程》。 本标准参考了OIE《陆生动物诊断试验与疫苗手册》（2012版）第2.3.1.章中禽衣原体病诊断中的相关技术。 本标准的附录A为资料性附录，附录B、附录C、附录D为规范性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：刘小丛、伍彦、林志雄、吴晓薇、梁刚、朱道中。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： ——SN/T 1395.1-2004 ——SN/T 1395.2-2005 ——SN/T 1395.3-2005禽衣原体病检疫技术规范 1 范围 本标准规定了禽衣原体病的检疫技术规范，包括间接红细胞凝集试验、琼脂免疫扩散试验、间接补体结合试验。 本标准适用于禽类衣原体病抗体的血清学检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 概述 禽衣原体病相关资料参见附录A 。 4 样品采集 本试验检测样品为禽鸟类动物血清。样品应无菌采集，且不溶血、不腐败。样品4℃时可保存5 d，长期存样应－18℃冷藏保存,试验前56℃水浴灭能30～35 min。 5 实验室诊断 5.1. 间接红细胞凝集试验 5.1.1. 设备、试剂及材料 5.1.1.1 主要设备 恒温水浴箱，96孔V型微量反应板，25 μL 、50 μL微量移液器，微量振荡器，超净工作台，恒温培养箱，高压消毒器，台式离心机。 5.1.1.2 稀释液 含1%灭能兔血清的pH 7.0磷酸缓冲液（PBS）B， 5.1.1.3 诊断试剂 敏化红细胞，标准阳性血清，标准阴性血清。 5.1.2 方法 每份被检血清倍比稀释至第6孔，每次检测设一对照试验组，包括敏化红细胞空白对照、阳性及阴性血清对照试验，试验操作程序见表1。 被检血清检测程序如下： ——每孔滴加稀释液50 μL； ——将被检血清50 μL加入第1孔，依次作倍比稀释至第6孔，最后弃去50 μL； ——每孔加入敏化红细胞25μL； ——置反应板于微量振荡器上振荡1 min，混匀； ——将反应板加盖，37℃或室温感作30 min～120 min，以对照孔出现结果时判读。 表1 禽衣原体间接红细胞凝集试验操作程序及结果判定举例 单位为微升 成分 被检血清稀释度 各项对照试验 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 空白对照 阳性血清对照 阴性血清对照 稀释液 50 50 50 50 50 50 50 被检血清 50 50 50 50 50 50 弃去50 阳性对照血清 50 阴性对照血清 50 敏化红细胞 25 25 25 25 25 25 25 25 25 置反应板于微量振荡器上振荡1 min，37℃或室温感作 结果判定举例 ++++ ++++ ++++ +++ ++ － － ++++ － 注：所示被检血清红细胞凝集效价为1∶32。 5.1.4 结果判定 5.1.4.1 凝集程度的判别标准和红细胞凝集效价 5.1.4.1.1 凝集程度的判别标准 ＋＋＋＋ ＋＋＋：红细胞在孔底形成一层薄膜，面积比前者小。 ＋＋：红细胞在孔底形成薄层凝集，边缘松散或呈锯齿状。 ＋：红细胞在孔底呈小圆点，周围有稀疏散在的少量凝集。 ±: 红细胞沉于孔底，但周围不光滑或中心有空斑。 ―: 红细胞完全沉于孔底，呈光滑的圆点。 5.1.4.1.2 红细胞凝集效价 被检血清产生“++”红细胞凝集现象的最高稀释倍数为红细胞凝集效价。 5.1.4.2 结果判定 5.1.4.2.1 对照试验 敏化红细胞空白对照：应无自凝现象，为（―）。 阳性对照血清：应为（++++）。 阴性对照血清： 5.1.4.2.2 检测判定标准 ——被检血清检测结果按以下标准判断： ——红细胞凝集效价为1∶16及以上，判为阳性； ——红细胞凝集效价为1∶4及以下，判为阴性； ——红细胞凝集效价介于二者之间的，判为可疑。 被检血清如出现可疑结果的，应作复检，复检结果仍为可疑的，判为阳性 。 5.2 琼脂免疫扩散试验 5