入境环保微生物菌剂检测方法 第6部分：金黄色葡萄球菌 意见稿.docVIP

ICS点击此处添加ICS号 点击此处添加中国标准文献分类号 SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T XXXXX—XXXX 进境环保微生物菌剂检测方法 第6部分：金黄色葡萄球菌 Methods for examination of import microbe agentia for environment protection Part 6: Staphylococcus aureus XXXX - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局发布 前言 本标准参考了PCR法》SN/T1869-2007中金黄色葡萄球菌的PCR法、《食品中致病菌检测方法 实时PCR法》SN/T1870-2007中金黄色葡萄球菌的实时PCR法。 本标准按照GB/T1.1—2009起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。 本标准主要起草人 进境环保微生物菌剂检测方法 第6部分：金黄色葡萄球菌 范围 本标准规定了PCR、实时荧光PCR检测方法。 本标准适用于。GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 对进行形态学生理生化PCR扩增或实时荧光PCR扩增等试验，GB19489中的有关规定执行。 主要试剂和培养基 生理盐水：见附录A中A.1章10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤：见附录A中A.2章7.5 %氯化钠肉汤：见附录A中A.3章：见附录A中A.4章Baird-Parker 琼脂平板见附录A中A.5章脑心浸出液肉汤(BHI)：见附录A中A.6章兔血浆：见附录A中A.7章革兰氏染色液：见附录A中A.8章营养琼脂小斜面：见附录A中A.9章DNA分子量标记：100 bp DNA ladder。dNTP：dATP、 dTTP、 dGTP 、dCTP。 TBE见附录A中A.10章。 Taq DNA 聚合酶。 细菌基因组DNA提取试剂盒。电子天平（感量0.01 g）。36 ℃±1 ℃。 恒温水浴锅。 台式离心机（最高转速15000 r/min）。 PCR扩增仪。 实时荧光PCR仪。 头：10 μL、20 μL、200 μL、1000 μL。 PCR超净工作台。 电泳仪。 核酸/蛋白分析仪。 凝胶成像系统。 90 mm。 1 g（mL）100 mL生理盐水中混匀，从中移取25 mL至盛有225 mL 灭菌生理盐水的无菌均质袋内，用拍击式均质器拍打1 min～2 min。取样过程中，在样品旁边放置1个营养琼脂平板作为空白对照。 从上述样品匀液中取25 mL加入到225 mL的7.5 %氯化钠肉汤的均质袋中混匀，于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。金黄色葡萄球菌在7.5 %氯化钠肉汤中呈混浊生长。将上述培养物，分别划线接种到Baird-Parker 平板和血平板，血平板36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。Baird-Parker 平板36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h 或45 h～48 h。 金黄色葡萄球菌在Baird-Parker 平板上，菌落直径为2 mm～3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。 染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为0.5 μm～1 μm。 挑取Baird-Parker 平板或血平板上可疑菌落1 个或以上，分别接种到5 mL BHI和营养琼脂小斜面，36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。 取新鲜配置兔血浆0.5 mL，放入小试管中，再加入BHI 培养物0.2 mL～0.3 mL，振荡摇匀，置36 ℃±1 ℃温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6 h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。 结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5 mL BHI，36 ℃±1 ℃培养18 h～48 h，重复试验。 综合以上8.2、8.4的结果，报告1 g/(mL)样品中检出（或未检出）金黄色葡萄球菌。 DNA的提取 直接提取