转基因玉米可视芯片检测方法.docVIP

ICS点击此处添加ICS号 点击此处添加中国标准文献分类号 SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 XX/T XXXXX—XXXX 转基因玉米可视芯片检测方法 Method for the Detection of Genetically Modified Corn Using Optical Thin-?lm Biosensor Chip 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 （本稿完成日期：2013-11-26） XXXX - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 前言 本标准依照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局，北京大学。 本标准主要起草人：章桂明、向才玉、凌杏园、潘广、陈浩东、邓兴旺。 转基因玉米可视芯片检测方法 范围 本标准规定了进出境玉米中转基因品系的可视芯片检测方法，规定了检测用引物、反应体系及条件，确定了结果判定标准。 本标准中检测方法适用于转基因玉米Bt176、59122、NK603、3272、GA21、MON810、MON88017、MON89034、MIR604、MON863、MOB87460、T25的品系检测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 6682 分析实验室用水规格和试验方法（eqv ISO 3696:1987） GB/T 19495.1 转基因产品检测 通用要求和定义 GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 GB/T 19495.3 转基因产品检测 核酸提取纯化方法 GB/T 19495.7 转基因产品检测 抽样和制样方法 SN/T 1193 基因检验实验室技术要求 原理 可视芯片技术是一种新型基因芯片，与传统基因芯片不同，它可以直接通过肉眼观察到的信号。将核酸探针按一定模式点置在芯片上制成检测芯片，通过多重PCR扩增获得的生物素化的PCR产物与芯片上的探针杂交，经由链霉亲和素-碱性磷酸酶介导的显色反应在芯片表面形成色点沉积，检测结果裸眼可视。 设备用具及试剂 主要设备及用具 组织粉碎机、PCR仪、水浴锅、电子天平（精度：1/1000以上）、低温冷冻高速离心机、低温冰箱、制冰机、恒温干燥箱、pH计、移液器（0.1 μL , 0.5 μL，2 μL, 10 μL, 20 μL, 100 μL, 200 μL, 1000 μL）、紫外可见分光光度计、纯水机、高压消毒锅、杂合反应仪（或使用可放置96孔板的恒温混匀器也可）、芯片点样仪、紫外交联仪、生物芯片、PCR管（0.2 mL）、离心管（1.5 mL，2.0 mL）、Tip 头（0.1 μL ~10 μL，5 μL ~200 μL，100 μL ~500 μL）。 主要试剂 CTAB Tris饱和酚 氯仿 异戊醇 异丙醇 70%酒精 RNA酶（10 mg/mL） Taq DNA聚合酶 探针缓冲液 175.3 g NaCl，88.2 g柠檬酸钠，溶于1000 mL焦碳酸二乙酯（DEPC）水中，HCl调节PH至7.0，高压灭菌。 漂洗缓冲液 800 mL 超纯水中溶解0.27 g KH2PO4，1.42 g Na2HPO4，8 g NaCl，0.2 g KCl，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1 L，高温高压灭菌后室温保存。使用时按体积比加入0.05%?Tween-20。 杂交反应液： 1000 mL 蒸馏水溶液中包括250 mL探针缓冲液，9.89 % 葡聚糖硫酸钠，1 % BSA，0.1 % SDS。 洗涤液 1000 mL 蒸馏水溶液中包括100 mL探针缓冲液，0.1 % SDS。 检测液 漂洗缓冲液加1% BSA，0.1% 标记有碱性磷酸酶的链霉亲和素溶液。 显色液 0.1 M Tris-HCl，0.15 M NaCl，1 mM MgCl2，调节pH至9.5。使用时新鲜配制，取5 mL 加入33 μL NBT，16.5 μL BCIP。 PCR对照探针 与检测目标无关的核酸杂交片段。其杂交目标是一段人工设计合成的核酸片段或者是一段特定的已知的目标核酸片段，在PCR反应时被掺入反应体系，参与整个检测流程。 杂交阳性对照探针 为一段5’端生物素修饰核酸片段，参与杂交后的显色反应过程。 杂交空白对照探针 无探针，溶液中的探针液全部为1X TE缓冲液。 用于可视芯片方法检测的引物和探针 用于可视芯片方法检测的引物和探针见表1。所有下游引物5’端用生物素修饰，探针加5’端加不同