DMT1参与β-淀粉样前体蛋白表达和Aβ分泌的机制研究-附.docVIP

附件2 论文中英文摘要格式 作者姓名：郑玮 论文题目：DMT1参与β-淀粉样前体蛋白表达和Aβ分泌的机制研究?前言 阿尔茨海默病 (Alzheimer’s disease，AD) 是一种发生于老年及老年前期的以进行性痴呆为主要特征的神经系统退行性疾病，其主要临床特征是进行性记忆丧失、认知缺陷及严重的精神障碍。AD的一个主要病理学标志是脑部出现淀粉样沉积，即老年斑。老年斑的核心成分是一种由39-43个氨基酸残基构成的小神经肽—Aβ (β-amyloid peptide)，Aβ由淀粉样前体蛋白 (amyloid precursor protein，APP) 经过β-分泌酶及γ-分泌酶水解并分泌至细胞外。在正常生理状态下，人脑内存在纳摩尔级浓度的可溶性Aβ，对神经元具有神经营养作用。但在AD时，APP的异常剪切加工、Aβ的形成及其从可溶状态到不溶状态的转变是AD发病机制中的关键环节，近年来的研究表明铁、铜和锌等金属离子与APP、β-分泌酶、γ-分泌酶和Tau蛋白的基因表达密切相关，从而参与Aβ分泌、沉积。以金属离子及金属离子转运蛋白为切入点，解析AD发病机制并寻找AD治疗靶点已经成为AD治疗学的热点之一。二价金属离子转运体 (divalent metal transporter 1， DMT1) 属于自然抵抗相关的巨噬细胞蛋白家族。DMT1蛋白有12个跨膜域，根据DMT1 mRNA的’端非翻译区 (3’-untranslational region，3’-UTR) 是否带有铁反应元件iron-response element，IRE)，可将DMT1分为DMT1-IRE和DMT1-nonIRE两种异构体，二者均定位于细胞膜和胞内循环的内吞小泡膜上，参与多种二价金属离子尤其是铁离子的转运，是维持细胞内二价金属离子稳态的重要金属转运蛋白之一。近年来有关DMT1与神经退行性疾病发病机理的研究引人关注，通过对Parkinson disease, PD) 患者和模型鼠的研究表明，DMT1在黑质的表达显著增强；而DMT1功能缺失鼠 (mk/mk小鼠) 却能拮抗1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)和6-羟多巴胺诱导的PD症状和黑质神经元死亡。令人感兴趣的是老龄大鼠脑内DMT1表达呈年龄性增高趋势；多种炎症因子也能使DMT1在脑内表达上调，这两种情况均是诱发AD的重要危险因素。然而，有关DMT1与AD发病机理的研究尚未见报道。 本研究对DMT1-IRE和DMT1-nonIRE在AD和APP/PS1转基因小鼠脑内的表达变化、定位分布及与Aβ的相关性进行系统分析，应用RNA干扰技术 (RNA interference，RNAi) 探讨DMT1基因沉默阻抑APP表达和Aβ分泌的效果，对深入探讨脑金属代谢紊乱与AD病理生理机制具有重要意义。 实验方法 采用AD病人尸检脑组织、双转染人APP695swe基因和人早老素 (presenilin， PS-1) 突变基因的AD模型小鼠 (APP/PS1小鼠) 及稳定转染APP695swe基因的SH-SY5Y细胞 (APPsw细胞) 为研究对象，应用免疫荧光双标和激光共聚焦扫描显微技术 (Confocal Laser Scanning Microscopy，CLSM) 检测DMT1在AD病人和APP/PS1小鼠脑内的定位分布及其与Aβ在老年斑内的位置关系，应用Western Blot技术检测APP/PS1小鼠大脑皮层海马DMT1的表达变化，应用免疫共沉淀技术 (co-immunoprecipitation，co-IP) 检测APP/PS1转基因小鼠脑内DMT1和Aβ的蛋白相关性，应用RNAi技术阻抑DMT1基因在稳定转染APPsw cDNA和空质粒neo的SH-SY5Y细胞的表达，并应用Western Blot技术检测RNAi对DMT1的基因沉默效果，应用Calcein AM荧光褪色光度法、RT-PCR技术、Western Blot技术、免疫荧光双标技术、ELISA技术、MTT技术检测T1-RNAi 对细胞铁离子转运、APP表达、Aβ分泌和细胞生存率的影响。 实验结果 一、DMT1异常分布和表达参与AD发生的体研究 1、DMT1在AD病人及APP/PS1转基因小鼠脑内的分布 免疫组织化学结果显示，DMT1-IRE和DMT1-nonIRE免疫阳性反应产物均呈棕黄色，在大脑皮层及海马内均可见DMT1阳性的老年斑分布，斑块大小不等，形状为圆形或不规则形状，边界较清晰。高倍镜下可见DMT1-IRE和DMT1-nonIRE广泛分布到整个老年斑内。此外，DMT1-IRE还广泛表达于淀粉样变性的血管壁及其周围。 免疫荧光双标的共聚焦激光扫描结果显示，在AD病人和APP/