实验四米氏常数（Km）和最大反应速度（Vm）的测定.docVIP

米氏常数（Km）和最大反应速度（Vm）的测定[原理] 在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶促反应的速度有很大的影响。在底物浓度很低时，酶促反应的速度（v）随底物浓度的增加而迅速增加；随着底物浓度的继续增加，反应速度的增加开始减慢；当底物浓度增加到某种程度时，反应速度达到一个极限值（Vmax）。 底物浓度与反应速度的这种关系可用Michaelis-Menten方程式表示： 式中 v——反应速度； Km——米氏常数； Vmax——酶反应最大速度； [S] ——底物浓度。 从米氏方程式可见：米氏常数Km等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，米氏常数的单位就是浓度单位(mol/L或mmol/L)。 在酶学分析中，Km是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。Km与底物浓度、酶浓度无关，与pH、温度、离子强度等因素有关。对于每一个酶促反应，在一定条件下都有其特定的Km值，因此可用于鉴别酶。 测定Km、Vmax，一般用作图法求得。作图法有很多，最常用的是Linewaver-Burk作图法，该法是根据米氏方程的倒数形式，以1/v对1/[S]作图，可得到一条直线(见图)。直线在横轴上的截距为 -1/Km，纵截距为1/Vmax，可求出Km与Vmax。 抑制剂影响酶促反应的因素之一，根据抑制剂与酶结合的特点可分为不可逆抑制和可逆抑制二种类型，其中可逆抑制有可分为三种类型：竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制。 （1）竞争性抑制类型： 酶不能同时与底物和抑制剂结合。动力学特征为：表观米氏常数Km增加，Vm不变。（下式中Ki为抑制剂常数，[I]为抑制剂浓度）。 （2）非竞争性抑制类型： 抑制剂、底物能同时与酶结合，但此复合物不能进一步分解为产物，Km不变，Vm下降。 （3）反竞争性抑制类型： 抑制剂必须在酶和底物结合后方能与酶形成复合物，但此物不能分解为产物。Km、Vm 都发生变化。 对于有抑制剂存在的酶促反应，也可采用1/v～1/[S]作图法，求出Km、Ki、 Vm，并利用各种可逆抑制类型的动力学特点判断抑制类型。 [试剂和器材] 1、试剂 [试剂和器材] 1、 2、器材： （1）恒温水浴槽 （2）分光光度计 （3）试管刻度吸管 [方法和步骤] O.D405 106 测定液体积（mL） v（μmol/L对-硝基酚/分）= × × t 18.8×103 1000 式中，O.D405为每管测定液，t为反应时间（分）。 反应液中底物浓度换算式： X ( M S = 3 式中，X为底物加入的ml数；3为反应液体积；M为加入时底物浓度（mmol/L）。 通过计算求得S，、v、1/s、1/v、I等值，然后作双倒数图，三条曲线作在同一曲线上，求出Km、Vm、Ki及抑制类型。 底物浓度[S] Vmax 反应速度 V 图 底物浓度对反应速度的影响 图 双倒数作图法 图 各抑制剂双倒数图